Традиційні діагностичні стратегії для виявлення інфекційних захворювань вимагають використання настільних приладів, які не підходять для тестування на місці надання медичної допомоги (POCT).Нова мікрофлюїдика — це дуже мініатюризована, автоматизована та інтегрована технологія, яка є потенційною альтернативою традиційним методам швидкої, недорогої та точної діагностики на місці.Молекулярні методи діагностики широко використовуються в мікрофлюїдних пристроях як найбільш ефективні методи виявлення патогенів.У цьому огляді узагальнено останні досягнення в мікрофлюїдній молекулярній діагностиці інфекційних захворювань як з академічної, так і з промислової точки зору.Спочатку ми описуємо типову обробку нуклеїнових кислот на чіпі, включаючи попередню обробку зразка, ампліфікацію та зчитування сигналу.Потім порівнюються характеристики, переваги та недоліки чотирьох типів мікрофлюїдних платформ.Далі ми обговоримо використання цифрових аналізів для абсолютного кількісного визначення нуклеїнових кислот.Як класичні, так і новітні комерційні молекулярні діагностичні пристрої на мікрофлюїдній основі узагальнено як докази поточного стану ринку.Нарешті, ми пропонуємо майбутні напрямки мікрофлюїдної діагностики інфекційних захворювань.
Інфекційні захворювання викликаються патогенними мікроорганізмами, включаючи бактерії, віруси та паразити, які поширені по всьому світу.На відміну від інших захворювань, збудники швидко заражаються та поширюються між людиною та тваринами-господарями через інокуляцію, повітря та воду [1].Профілактика інфекційних захворювань є критично важливою мірою громадського здоров’я.Три основні стратегії боротьби з інфекційними хворобами: (1) контроль над джерелом інфекції;(2) переривання шляху передачі;(3) захист сприйнятливих груп населення.Серед основних стратегій контроль над джерелом інфекції вважається найважливішою стратегією через її зручність і низьку вартість.Швидка діагностика, ізоляція та лікування інфікованих осіб є критично важливими, вимагаючи швидких, чутливих і точних діагностичних стратегій [2].Сучасна діагностика інфекційних захворювань зазвичай поєднує клінічне обстеження, засноване на ознаках і симптомах, і лабораторні дослідження, такі як культура клітин і молекулярна діагностика, які вимагають навченого персоналу, трудомістких процедур і дорогого обладнання для тестування [3, 4].Профілактика спалахів інфекційних захворювань вимагає швидкої, недорогої та точної локальної діагностики, особливо в районах з обмеженими ресурсами, де інфекційні захворювання є поширеними та важкими [5], а також лікування в дикій природі чи на полі бою, де надзвичайні ситуації непередбачувані..медичне обслуговування обмежене [6].У цьому контексті мікрофлюїдика — це технологія, яка поєднує технології мікроелектромеханічних систем, нанотехнології чи матеріалознавство для точного маніпулювання рідинами [7,8,9,10], надаючи нові можливості для виявлення на місці (POCT).) інфекційні агенти поза лікарнями та лабораторіями.У порівнянні з традиційною трудомісткою діагностикою, мікрофлюїдна технологія забезпечує економію зразків і кошти для молекулярної діагностики під час спалахів захворювання.Глобальне поширення коронавірусної хвороби 2019 (COVID-19) викликано важким гострим респіраторним синдромом коронавірусу 2 (SARS-CoV-2), тому знову підкреслюється важливість мікрофлюідики для своєчасної профілактики та контролю пандемії [11, 12]. , 13].На відміну від традиційної діагностики, мікрофлюїдна POCT використовує невеликі портативні пристрої, починаючи від настільних аналізаторів і закінчуючи невеликими тест-смужками бічного потоку для тестування поблизу точки відбору [14].Ці тести включають спрощену підготовку зразка або його відсутність, швидке посилення сигналу та чутливі зчитування сигналу, що призводить до короткої тривалості та отримання точних результатів протягом кількох хвилин.Доступність і масове виробництво мікрофлюїдних інструментів для охорони здоров’я розширили їх економічно ефективне та пряме діагностичне застосування поза лікарнею, поблизу пацієнта та навіть вдома.
Серед існуючих стратегій діагностики інфекційних захворювань молекулярна діагностика є однією з найбільш чутливих [15, 16].Крім того, молекулярна діагностика часто використовується як золотий стандарт для постійного виявлення COVID-19, що дозволяє безпосередньо виявляти вірусоспецифічні ділянки РНК або ДНК до початку імунної відповіді [17, 18].У поточному огляді ми представляємо останні досягнення в молекулярних діагностичних процесах інфекційних захворювань, заснованих на мікрофлюїдіці, з академічної точки зору до майбутніх промислових перспектив (рис. 1).Ми почнемо з трьох ключових етапів виявлення нуклеїнових кислот: попередньої обробки зразка на чіпі, ампліфікації нуклеїнової кислоти та зчитування сигналу.Потім ми порівняли різні типи мікрофлюїдних платформ з їх структурою та функціями, показавши унікальні характеристики (сильні та слабкі сторони).Далі обговорюється цифрове виявлення нуклеїнових кислот і наводиться як приклад технології третього покоління для абсолютного кількісного визначення молекул інфекційних патогенів.Крім того, буде представлено кілька типових і останніх комерційних пристроїв POCT, щоб продемонструвати поточний стан ринку мікрофлюїдних POCT для молекулярної діагностики.Ми також обговоримо та пояснимо наше бачення майбутніх програм.
Модулі мікрофлюїдних чіпів для виявлення нуклеїнових кислот можна розділити на три категорії (відбір проб, розпізнавання та передача сигналів) відповідно до їх функцій [19].Серед цих модулів модуль відбору зразків в основному реалізує лізис зразка та екстракцію нуклеїнової кислоти.Сенсорний модуль головним чином контролює перетворення та посилення сигналів нуклеїнових кислот.Модуль сигналізації виявляє сигнал, перетворений і оброблений сенсорним модулем.Базуючись на процесі виявлення нуклеїнових кислот на чіпі, ми узагальнимо різні чіпи, які можуть реалізувати функцію «введення та виведення».
Першим кроком у виявленні нуклеїнової кислоти є екстракція нуклеїнової кислоти, тобто виділення цільової нуклеїнової кислоти з вихідного зразка.Екстракція нуклеїнових кислот проводиться для очищення нуклеїнових кислот від інших молекулярних забруднень, забезпечення цілісності первинної структури молекул нуклеїнових кислот та оптимізації результатів.Екстракція нуклеїнової кислоти вимагає необхідного лізису зразка та захоплення нуклеїнової кислоти, якість та ефективність яких має величезний вплив на результати дослідження та діагностики.Будь-які незначні побічні ефекти під час екстракції можуть обмежити подальше виявлення.Наприклад, методи полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і петлевої ізотермічної ампліфікації (LAMP) інгібуються деякими залишковими органічними розчинниками, такими як етанол і ізопропанол у реагентах для виділення нуклеїнових кислот [20].Рідинно-рідинна екстракція та твердофазна екстракція є найпопулярнішими методами виділення нуклеїнових кислот [21], однак рідинно-рідинна екстракція на чіпі надзвичайно обмежена, оскільки реагенти, що використовуються в рідинно-рідинній екстракції, викликають корозію більшості мікрофлюїдних чіпів. .Тут ми висвітлюємо методи твердофазної екстракції на основі мікрочіпів і порівнюємо їхні переваги та недоліки.
Кремній є субстратним матеріалом, сумісним з нуклеїновими кислотами завдяки своїй біосумісності, стабільності та легкості модифікації [22].Важливо, що при модифікації кремнеземом або іншими матеріалами цей композит виявляє властивості адсорбувати негативно заряджені нуклеїнові кислоти в умовах низького рН і високої солі, одночасно елююючи розчинами з високим рН і низьким вмістом солі.На основі цього явища можна очистити нуклеїнову кислоту.
Для екстракції нуклеїнових кислот у мікрофлюїдіці використовувалися різні форми матеріалів на основі кремнезему, такі як кремнеземні кульки, порошки, фільтри з мікроволокна та кремнеземні мембрани [23, 24, 25, 26].Залежно від властивостей матеріалу матеріали на основі кремнію можуть використовуватися в мікросхемах по-різному.Наприклад, гранули кремнезему, порошки та комерційні нанофільтри можна просто помістити в пори або мікроканали мікрофлюїдних чіпів і допомогти вилучити нуклеїнові кислоти зі зразків [27, 28, 29].Поверхнево-модифіковані кремнеземні мембрани також можна використовувати для швидкого очищення ДНК від патогенів за низьку вартість.Наприклад, Wang et al.[30] Завдяки поєднанню реакцій денатурації ампліфікації з опосередкованим везикулами обміном ланцюгом із кремнеземними мембранами, вкритими олігосахаридами хітозану, була представлена універсальна портативна система, яка успішно виявляла 102–108 колонієутворюючих одиниць.(КУО)/мл Vibrio parahaemolyticus., і наявність вірусу було легко видно.Powell та ін.[31] Потім для виявлення вірусу гепатиту С (ВГС), вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), вірусу Зіка та вірусу папіломи людини та автоматичного розмноження були використані мікроматриці на основі кремнію, у яких був розроблений звивистий мікрореактор об’ємом 1,3 мкл для захоплення РНК-вірусів.і виконати підсилення in situ.На додаток до цих методів, поверхнево-модифіковані мікроколонки з кремнеземом також відіграють ключову роль у екстракції нуклеїнових кислот, оскільки геометрія та властивості модифікуючого матеріалу значно підвищують ефективність екстракції.Чен та ін.[32] запропонували мікрофлюїдну платформу для виділення РНК низької концентрації на основі кремнієвих мікроколонок з аміно-покриттям.Цей мікрофлюїдний пристрій об’єднує масив мікростійків площею 0,25 см2 на кремнієвій підкладці для досягнення вищої ефективності екстракції завдяки високому відношенню площі поверхні до об’єму.Перевага цієї конструкції полягає в тому, що мікрофлюїдний пристрій може досягти ефективності вилучення нуклеїнової кислоти до 95%.Ці стратегії на основі кремнію демонструють цінність швидкого виділення нуклеїнових кислот за низькою ціною.У поєднанні з мікрофлюїдними чіпами стратегії екстракції на основі кремнію можуть не тільки підвищити ефективність виявлення нуклеїнових кислот, але й полегшити мініатюризацію та інтеграцію аналітичних пристроїв [20].
Методи магнітного розділення використовують магнітні частинки для виділення нуклеїнових кислот у присутності зовнішнього магнітного поля.Зазвичай використовувані магнітні частинки включають магнітні частинки Fe3O4 або γ-Fe2O3, вкриті кремнеземом, аміно та карбоксилом [33,34,35,36].Відмінною рисою магнітних частинок порівняно з методами SPE на основі кремнію є легкість маніпулювання та керування за допомогою зовнішніх магнітів.
Використовуючи електростатичну взаємодію між нуклеїновими кислотами та діоксидом кремнію, в умовах високого вмісту солі та низького рН, нуклеїнові кислоти адсорбуються на поверхні магнітних частинок, покритих діоксидом кремнію, тоді як в умовах низького вмісту солі та високого рН, молекули можуть бути вимиті. знову..Магнітні кульки, покриті кремнеземом, дають змогу витягувати ДНК із зразків великого об’єму (400 мкл) за допомогою магнітно керованого руху [37].Як демонстрацію, Rodriguez-Mateos et al.[38] використовували регульовані магніти для керування перенесенням магнітних кульок до різних камер.На основі магнітних частинок, покритих кремнеземом, 470 копій/мл геномної РНК SARS-CoV-2 можна виділити зі зразків стічних вод для виявлення зворотної транскрипції LAMP (RT-LAMP), і відповідь можна прочитати протягом 1 години.неозброєним оком (рис. 2а).
Прилади на основі магнітних і пористих матеріалів.Концептуальна схема мікрофлюїдного пристрою IFAST RT-LAMP для виявлення РНК SARS-CoV-2 (адаптовано з [38]).b Центрифужний мікропристрій для dSPE нуклеїнової кислоти буккального мазка (адаптовано з [39]).c Вбудований концентратор проб із автономним живленням за допомогою карти FTA® (адаптовано з [50]).d Фільтровий папір Fusion 5, модифікований хітозаном (адаптовано з [51]).SARS-CoV-2 тяжкий гострий респіраторний синдром, коронавірус 2, ізотермічна ампліфікація, опосередкована петлею зворотної транскрипції RT-LAMP, технологічні партнери FTA finders, нуклеїнова кислота NA
Позитивно заряджені магнітні частинки ідеально підходять для приєднання фосфатної основи нуклеїнової кислоти.При певній концентрації солі негативно заряджені фосфатні групи нуклеїнових кислот можуть бути позитивно заряджені на поверхні частинок магнітного композиту.Тому для екстракції нуклеїнових кислот були розроблені магнітні наночастинки з шорсткою поверхнею та високою щільністю аміногруп.Після магнітного розділення та блокування магнітні наночастинки та ДНК-комплекси можна безпосередньо використовувати в ПЛР, що усуває потребу в складних і трудомістких операціях очищення та елюції [35].Магнітні наночастинки, вкриті негативними карбоксильними групами, також використовували для розділення нуклеїнових кислот, адсорбованих на поверхнях у висококонцентрованих розчинах поліетиленгліколю та хлориду натрію [36].За допомогою цих поверхнево-модифікованих магнітних кульок екстракція ДНК сумісна з подальшою ампліфікацією.Dignan та ін.[39] описав автоматизовану та портативну відцентрову мікрофлюїдну платформу для попередньої обробки нуклеїнових кислот, що дозволяє нетехнічному персоналу використовувати її на місці.Крім того, сумісність ізольованої ДНК з LAMP, методом, який добре підходить для аналізу нуклеїнових кислот у місці надання медичної допомоги, додатково демонструє мінімальні вимоги до обладнання та придатність для колориметричних аналізів (рис. 2b).
Методи магнітних кульок пропонують можливість автоматизованої екстракції, деякі з яких існують у комерційних автоматизованих екстракторах нуклеїнових кислот [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, США), QIAcube® HT;CapitalBio (Пекін, Китай) і Biomek®;Бекман (Маямі, США).), Флорида, США)].Переваги поєднання магнітних кульок із мікрофлюїдикою можна використовувати для ефективної автоматизованої екстракції нуклеїнових кислот, що потенційно може сприяти розвитку молекулярної діагностики;однак поєднання магнітних кульок із мікрофлюїдикою все ще значною мірою залежить від складних систем керування для точного маніпулювання магнітними кульками, що пояснює популярність комерційних продуктів, які є громіздкими та дорогими, що обмежує подальше застосування магнітних кульок у POCT.
Деякі пористі матеріали, такі як модифіковані нітроцелюлозні фільтри, картки Finders Technology Associates (FTA), фільтрувальний папір на основі поліефірсульфону та матеріали з глікановим покриттям також використовувалися для виявлення нуклеїнових кислот [40, 41, 42, 43, 44].Пористі волокнисті матеріали, такі як волокнистий папір, вперше використовувалися для ізоляції ДНК шляхом фізичного переплутування довголанцюгових молекул ДНК волокнами.Маленькі пори призводять до сильного фізичного обмеження молекул ДНК, що позитивно позначається на екстракції ДНК.Через різні розміри пор волокнистого паперу ефективність екстракції не може задовольнити потреби ампліфікації ДНК [45, 46].Картка FTA — це комерційний фільтрувальний папір, який використовується в галузі судової медицини та широко використовується в інших областях молекулярної діагностики.Завдяки використанню целюлозного фільтрувального паперу, просоченого різними хімікатами для лізису клітинних мембран у зразку, вивільнена ДНК захищена від деградації протягом 2 років.Зовсім недавно був розроблений просочений целюлозний папір для молекулярного виявлення різних патогенів, включаючи SARS-CoV-2, лейшманіоз і малярію [47,48,49].ВІЛ в ізольованій плазмі безпосередньо лізується, а вірусна нуклеїнова кислота збагачується в проточній мембрані FTA®, вбудованій у концентратор, що забезпечує ефективне виробництво нуклеїнової кислоти [50] (рис. 2c).Основна проблема з виявленням нуклеїнових кислот за допомогою карт FTA полягає в тому, що такі хімічні речовини, як гуанідин та ізопропанол, пригнічують наступні реакції ампліфікації.Щоб вирішити цю проблему, ми розробили фільтрувальний папір Fusion 5, модифікований хітозаном, який поєднує в собі переваги як фізичного переплетення молекул ДНК і волокнистого фільтрувального паперу, так і електростатичної адсорбції ДНК на модифікованих хітозаном сполуках для досягнення високоефективної екстракції нуклеїнових кислот. ..волокна фільтра [51] (рис. 2d).Подібним чином Zhu et al.[52] продемонстрували модифікований хітозаном метод ПЛР на основі капілярної мікрофлюїдної системи in situ для швидкого виділення та виявлення РНК вірусу Зіка.Нуклеїнові кислоти можна адсорбувати/десорбувати в середовищі змішаного лізату/ПЛР, відповідно, на основі властивості перемикання хітозану.увімкнення та вимкнення», реагуючи на pH.
Як згадувалося вище, ці стратегії поєднують переваги різних твердофазних матеріалів і підвищують ефективність екстракції нуклеїнової кислоти в мікрофлюїдіці.У практичних застосуваннях використання цих матеріалів у великих кількостях є неекономічним, і належна обробка поверхні або модифікація поверхні звичайних матеріалів за допомогою цих матеріалів також може зберегти їхню функцію.Тому вважається, що впровадження цих стратегій після пілотного дослідження може знизити витрати.
Тестування нуклеїнових кислот на мікрофлюїдних платформах часто використовує невеликі об’єми зразків (< 100 мкл), тому вимагає ампліфікації цільових нуклеїнових кислот за допомогою специфічних зондів для перетворення в сигнал, зручний для подальшого виявлення (оптичний, електричний та магнітний) [53, 54]. Тестування нуклеїнових кислот на мікрофлюїдних платформах часто використовує невеликі об’єми зразків (< 100 мкл), тому вимагає ампліфікації цільових нуклеїнових кислот за допомогою специфічних зондів для перетворення в сигнал, зручний для подальшого виявлення (оптичний, електричний та магнітний) [53, 54]. При тестуванні нуклеїнових кислот на мікрожидкостних платформах часто використовуються невеликі об’єми зразків (< 100 мкл), тому потрібна ампліфікація цілевих нуклеїнових кислот за допомогою спеціальних зондів для перетворення в сигнал, зручний для подальшого виявлення (оптичного, електричного та магнітного) [53, 54]. При тестуванні нуклеїнових кислот на мікрофлюїдних платформах часто використовуються невеликі об’єми зразків (<100 мкл), тому необхідна ампліфікація цільових нуклеїнових кислот спеціальними зондами для перетворення їх у сигнал, зручний для подальшої детекції (оптичний, електричний та магнітний). [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 µl） ， 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 核酸 ， 以 为 便于 下游 检测 （光学 电学 和 磁学） 的 信号 信号 信号 检测 光学 电学 和） 的 信号 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量. ]。 Обнаруження нуклеїнових кислот на мікрожидкостних платформах зазвичай використовує невеликі об’єми зразків (<100 мкл), що вимагає ампліфікації цілевих нуклеїнових кислот за допомогою спеціальних зондів для перетворення в сигнали для післядуючого виявлення (оптичного, електричного та магнітного) [53, 54]]. Для виявлення нуклеїнових кислот на мікрофлюїдних платформах зазвичай використовуються невеликі об’єми зразків (<100 мкл), що вимагає ампліфікації цільових нуклеїнових кислот спеціальними зондами для перетворення їх у сигнали для подальшої детекції (оптичні, електричні та магнітні) [53, 54]] .Ампліфікація нуклеїнової кислоти в мікрофлюїдиці також може прискорити реакції, оптимізувати межі виявлення, зменшити вимоги до зразків і підвищити точність виявлення [55, 56].Останніми роками, з реалізацією швидкого та точного виявлення, різні методи ампліфікації нуклеїнових кислот були застосовані в мікрофлюїдиці, включаючи ПЛР та деякі ізотермічні реакції ампліфікації.У цьому розділі буде підсумовано методи виявлення нуклеїнових кислот на основі мікрофлюїдних систем.
ПЛР – це моделювання процесу реплікації ДНК організму, теорія якого детально описана в іншому місці та не буде обговорюватися тут.ПЛР може ампліфікувати дуже невелику кількість цільової ДНК/РНК з експоненціальною швидкістю, що робить ПЛР потужним інструментом для швидкого виявлення нуклеїнових кислот.В останні десятиліття було розроблено багато портативних мікрофлюїдних пристроїв, обладнаних системами термоциклізації ПЛР, щоб задовольнити потреби діагностики на місці надання медичної допомоги [57, 58].ПЛР на чіпі можна розділити на чотири типи (звичайний, безперервний потік, просторово перемикається та конвективний ПЛР) відповідно до різних методів контролю температури [59].Наприклад, Gee et al.[60] розробили метод кількісної ПЛР із прямою зворотною транскрипцією (RT-qPCR) на власній мікрофлюїдній платформі для мультиплексного виявлення SARS-CoV-2, вірусів грипу А та В у зразках мазків із горла (рис. 3a).Парк та ін.[61] створили простий чіп для аналізу патогенів, об’єднавши тонкоплівкову ПЛР, електроди та мікрофлюїдний модуль на основі полідиметилсилоксану, що керується пальцем.Однак обидві роботи втілюють спільні недоліки звичайної ПЛР.Для ПЛР необхідний термоцикл, що обмежує подальшу мініатюризацію пристрою та скорочує час тестування.
Розробка мікрофлюїдної ПЛР на основі безперервного потоку та ПЛР з перемиканням простору має вирішальне значення для вирішення цієї проблеми.Використовуючи довгий змієподібний канал або короткий прямий канал, ПЛР безперервного потоку може забезпечити швидку ампліфікацію завдяки активній циркуляції реагентів у трьох зонах попереднього нагріву за допомогою насоса поза мікросхемою.Ця операція успішно дозволяє уникнути фази переходу між різними температурами реакції і таким чином значно скорочує час тестування [62] (рис. 3b).В іншому дослідженні Jung et al.[63] запропонували новий ротаційний генетичний аналізатор ПЛР, який поєднує в собі характеристики фіксованої та проточної ПЛР для ультрашвидкої та мультиплексної ПЛР зі зворотною транскрипцією (рис. 3c).Для ампліфікації нуклеїнової кислоти мікрочіп ПЛР буде проходити через три нагрівальні блоки при різних температурах: 1. Блок денатурації 94°C, 2. Блок відпалу при 58°C, 3. Блок розширення при 72°C.
Застосування ПЛР в мікрофлюїдіці.Схематичне зображення dirRT-qPCR на мікрофлюїдній платформі (адаптовано з [60]).b Схематичне зображення мікроматриці ПЛР безперервного потоку на основі змієподібного каналу (адаптовано з [62]).c Схематичне зображення ротаційного генетичного аналізатора ПЛР, що складається з мікрочіпа, трьох нагрівальних блоків і крокового двигуна (адаптовано з [63]).d Діаграма термоконвекційної ПЛР з центрифугуванням і налаштуванням (адаптовано з [64]).DirRT-qPCR, пряма кількісна полімеразна ланцюгова реакція зворотної транскрипції
Використовуючи капіляри та петлі або навіть тонкі пластини, конвекційна ПЛР може швидко ампліфікувати нуклеїнові кислоти за допомогою природної вільної теплової конвекції без потреби у зовнішньому насосі.Наприклад, мікрофлюїдна платформа з циклічного олефінового полімеру була розроблена на виготовленій обертовій сцені нагріву, яка використовує термічний цикл із центрифугуванням у мікроканалі циклу ПЛР [64] (рис. 3d).Реакційний розчин приводиться в дію тепловою конвекцією, яка безперервно обмінюється високою та низькою температурою в мікроканалі з кільцевою структурою.Весь процес ампліфікації можна завершити за 10 хвилин із межею виявлення 70,5 пг/канал.
Як і очікувалося, швидка ПЛР є потужним інструментом для повністю інтегрованих систем молекулярної діагностики та мультиплексного аналізу зразка-відповіді.Швидка ПЛР значно скорочує час, необхідний для виявлення SARS-CoV-2, що сприяє ефективному контролю пандемії COVID-19.
ПЛР вимагає складного термоциклера, який не підходить для ПОКТ.Зовсім недавно методи ізотермічної ампліфікації були застосовані до мікрофлюїдики, включаючи, але не обмежуючись, LAMP, рекомбіназну полімеразну ампліфікацію (RPA) і ампліфікацію на основі послідовностей нуклеїнових кислот [65,66,67,68].За допомогою цих методів нуклеїнові кислоти ампліфікуються при постійній температурі, що полегшує створення недорогих високочутливих портативних пристроїв POCT для молекулярної діагностики.
Високопродуктивні мікрофлюїдичні аналізи LAMP дозволяють багаторазово виявляти інфекційні захворювання [42, 69, 70, 71].У поєднанні з відцентровою мікрофлюїдною системою LAMP може додатково полегшити автоматизацію виявлення нуклеїнових кислот [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip був розроблений для візуального виявлення кількох паралельних бактерій за допомогою LAMP [76] (рис. 4a).При використанні оптимізованого LAMP в аналізі співвідношення сигнал/шум флуоресценції було приблизно в 5 разів, а межа виявлення досягала 7,2 копії/мкл геномної ДНК. Крім того, існування п’яти поширених травних бактеріальних патогенів, включаючи Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis і Vibrio parahaemolyticus, було візуалізовано на основі цього методу за < 60 хв. Крім того, існування п’яти поширених травних бактеріальних патогенів, включаючи Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis і Vibrio parahaemolyticus, було візуалізовано на основі цього методу за < 60 хв.Крім того, за допомогою цього методу менш ніж за 60 хвилин було візуалізовано наявність п’яти поширених бактеріальних патогенів травного тракту, включаючи Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis і Vibrio parahaemolyticus.此外 ， 基于 该 在 在 <60 分钟 内 可 视化 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 沙门 菌 、 河流 弧菌 副溶血性 弧菌。 肠 氏 河流 弧菌 副溶血性 弧菌。。 氏 、 弧菌 和 弧菌。。此外 ， 基于 该 在 在 <60 分钟 内 视化 了 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 大 肠杆菌 、 肠 菌 菌 、 和 副溶血 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPКрім того, присутність п’яти поширених бактеріальних шлунково-кишкових патогенів, включаючи Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius і Vibrio parahaemolyticus, було візуалізовано за допомогою цього методу менш ніж за 60 хвилин.
Переваги LAMP у мікрофлюїдіці включають, серед іншого, швидку реакцію та мініатюрне виявлення.Однак через температуру реакції (близько 70°C) під час LAMP неминуче утворюються аерозолі, що призводить до високої частоти помилкових позитивних результатів.Специфічність аналізу, дизайн праймера та контроль температури також потребують оптимізації для LAMP.Крім того, конструкції чіпів, які реалізують виявлення кількох цілей на одному чіпі, мають велике значення та мають бути розроблені.Крім того, LAMP підходить для багатоцільового виявлення, інтегрованого в один чіп, що має велике значення, але є ще багато можливостей для розвитку.
Високий рівень хибнопозитивних результатів LAMP можна частково зменшити за допомогою RPA, оскільки відносно низька температура реакції (~37 °C) призводить до відносно незначних проблем з випаровуванням [77].У системі RPA два протилежних праймера ініціюють синтез ДНК шляхом зв’язування з рекомбіназою, і ампліфікація може бути завершена протягом 10 хвилин [78,79,80,81].Таким чином, весь процес RPA набагато швидший, ніж PCR або LAMP.В останні роки було показано, що мікрофлюїдна технологія ще більше покращує швидкість і точність RPA [82,83,84].Наприклад, Liu et al.[85] розробили мікрофлюїдний інтегрований аналіз полімеразно-рекомбіназної ампліфікації з бічним потоком для швидкого та чутливого виявлення SARS-CoV-2 шляхом інтеграції зворотної транскрипції RPA (RT-RPA) та універсальної системи виявлення тест-смужок з бічним потоком.в єдину мікрофлюїдну систему.Малюнок 4b).Межа виявлення становить 1 копію/мкл або 30 копій/зразок, і виявлення може бути завершено приблизно за 30 хвилин.Kong та ін.розробили переносний мікрофлюїдний пристрій.[86] використовували температуру тіла та систему виявлення флуоресценції на основі мобільного телефону для швидкого та безпосереднього виявлення ДНК ВІЛ-1 за допомогою RPA (рис. 4c).Носійний аналіз RPA виявляє 100 копій/мл цільової послідовності протягом 24 хвилин, демонструючи великий потенціал для швидкої діагностики ВІЛ-1-інфікованих немовлят в умовах обмежених ресурсів.
Ізотермічна ампліфікація в тестуванні на місці (POCT).Розробка та виробництво спінового та реакційного SlipChip.Після плазмового зварювання верхній і нижній чіпи були зібрані за допомогою набору гайок для формування остаточного чіпа (адаптовано з [76]).b Схема системи MI-IF-RPA для виявлення COVID-19 (адаптовано з [85]).c Схема тесту RPA для швидкого виявлення ДНК ВІЛ-1 (адаптовано з [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, вірус імунодефіциту людини HIV, ампліфікація полімерази рекомбінази RPA, LED світлодіод, MI-IF-RPA Microfluidics Integrated Lateral Flow Recombinase-Polymerase Ампліфікація
RPA на основі мікрофлюїдів швидко розвивається, однак вартість виготовлення чіпа та споживання реакції занадто високі, і їх необхідно зменшити, щоб підвищити доступність цієї технології.Крім того, висока чутливість RPA може впливати на посилення неспецифічних продуктів, особливо за наявності контамінації.Ці обмеження можуть вплинути на застосування RPA в мікрофлюїдних системах і заслуговують на подальшу оптимізацію.Добре розроблені праймери та зонди для різних мішеней також необхідні для покращення здійсненності мікрофлюїдних стратегій на основі RPA у POCT.
Cas13 і Cas12a мають здатність випадковим чином розщеплювати нуклеїнові кислоти і тому можуть бути розроблені як засоби виявлення та діагностики.Cas13 і Cas12a активуються при зв'язуванні з цільовою ДНК або РНК відповідно.Після активації білок починає розщеплювати інші сусідні нуклеїнові кислоти, після чого направляючі РНК, націлені на специфічні для патогенів нуклеїнові кислоти, можуть розщеплювати погашені флуоресцентні зонди та вивільняти флуоресценцію.Спираючись на цю теорію, Kellner et al.[87] розробили метод на основі Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], а Broughton et al.[88] розробили інший підхід на основі Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
Останніми роками з'явилися різні методи виявлення нуклеїнових кислот на основі CRISPR [89, 90].Звичайні методи на основі CRISPR часто вимагають багато часу та праці через численні процедури, включаючи екстракцію нуклеїнової кислоти, ампліфікацію та виявлення CRISPR.Вплив рідини на повітря може збільшити ймовірність хибнопозитивних результатів.Враховуючи вищесказане, системи на основі CRISPR гостро потребують оптимізації.
Пневматично керована мікрофлюїдна платформа, яка може виконувати 24 аналізи паралельно, була розроблена для програм виявлення CRISPR-Cas12a та CRISPR-Cas13a [91].Система оснащена пристроєм виявлення флуоресценції, який обходить ампліфікацію нуклеїнових кислот і автоматично виявляє фемтомолярні зразки ДНК і РНК.Чен та ін.[92] інтегрована ампліфікація рекомбінази з системою CRISPR-Cas12a у відцентровій мікрофлюїдиці (рис. 5a).Ця робота долає труднощі інтеграції цих двох процесів, оскільки Cas12a може перетравлювати месенджерну ДНК і гальмувати процес ампліфікації.Крім того, Chen et al.[92] додатково попередньо зберігали реакційні реагенти у відцентровому мікрофлюїдному контролі для автоматичного завершення всього процесу.В іншій роботі Silva et al.[93] розробили діагностичний метод без ампліфікації CRISPR/Cas12a та смартфон для виявлення SARS-CoV-2 (рис. 5b).Цей аналіз, відомий як система без ампліфікації на основі мобільного телефону, включає CRISPR/Cas-залежний фермент, який базується на візуалізації смартфоном сигналів бульбашок, створених каталазою, у мікрофлюїдних каналах.Чутливе виявлення менше 50 копій/мкл нуклеїнової кислоти без попередньої ампліфікації, весь процес від введення зразка до зчитування сигналу займає лише 71 хвилину.
Методи виявлення нуклеїнових кислот на основі CRISPR.Відцентровий POCT для комплексної молекулярної діагностики на основі CRISPR (адаптовано з [92]).b Розробка тесту CASCADE для аналізу SARS-CoV-2 на основі смартфона (адаптовано з [93]).Ампліфікація рекомбінази RAA, прилеглий протоспейсерний мотив PAM, кластеризовані короткі паліндромні повтори CRISPR через регулярні проміжки часу, система CASCADE без ампліфікації мобільного телефону з CRISPR/CAS-залежними ферментами, 1-етил-3-[3-диметиламінопропіл]карбодиімід гідрохлорид EDC
Будучи останнім кроком у виявленні нуклеїнових кислот, виявлення сигналу безпосередньо відображає результати діагностики та є критичним фактором у розробці ефективної, чутливої та точної POCT.Сигнали можна зчитувати різними методами, такими як флуоресцентні, електрохімічні, колориметричні та магнітні стратегії.У цьому розділі ми описуємо обґрунтування кожного підходу та порівнюємо молекулярну діагностику інфекційних захворювань у мікрофлюїдіці.
Стратегії, засновані на флуоресценції, широко використовуються для POCT-діагностики інфекційних захворювань завдяки їхнім чудовим перевагам, а саме чудовій чутливості, низькій вартості, простоті роботи та аналізу на місці надання медичної допомоги [94, 95].У цих стратегіях використовуються мічені флуорофори, такі як флуоресцентні барвники та наноматеріали, для створення виявленого сигналу (посилення або гасіння флуоресценції).Цей висновок свідчить про те, що стратегії, засновані на флуоресценції, можна розділити на пряме флуоресцентне мічення, флуоресцентне виявлення сигналу та вимкнення сигналу [96].Пряме виявлення флуоресцентної мітки використовує спеціальні флуоресцентні мітки для позначення конкретних лігандів, які генерують певну кількість флуоресценції при вибірковому зв’язуванні з мішенню.Для виявлення флуоресценції на основі сигналу якість флуоресцентного сигналу позитивно пов’язана з величиною інтересу.Інтенсивність флуоресценції є незначною за відсутності мішені та виявляється, коли присутня достатня кількість мішені.І навпаки, інтенсивність флуоресценції, що виявляється за допомогою флуоресценції «відключення сигналу», обернено пропорційна кількості мішені, спочатку досягаючи максимального значення та поступово зменшуючись у міру збільшення мішені.Наприклад, використовуючи залежний від мішені механізм транс-розщеплення CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] розробили нову стратегію розпізнавання для виявлення РНК, які безпосередньо обходять зворотну транскрипцію (рис. 6а).Після зв’язування з комплементарними цільовими РНК комплекс CRISPR-Cas13-РНК може бути активований, запускаючи трансколатеральне розщеплення неспецифічними репортерними РНК.Флуоресцентно мічений репортер [флуорофор (F)] гаситься гасником (Q) незмінним і флуоресцує, коли розщеплюється активованим комплексом.
Перевагою електрохімічного виявлення є висока швидкість виявлення, легке виробництво, низька вартість, легкість транспортування та автоматичний контроль.Це потужний аналітичний метод для додатків POCT.На основі графенових польових транзисторів Gao et al.[98] розробили нанобіосенсор для мультиплексного виявлення антигенів хвороби Лайма з бактерій Borrelia burgdorferi з межею виявлення 2 пг/мл (рис. 6b).
Колориметричні аналізи використовувалися в програмах POCT, маючи переваги мобільності, низької вартості, простоти приготування та візуального зчитування.Колориметричне виявлення може використовувати окислення пероксидази або пероксидазоподібних наноматеріалів, агрегацію наноматеріалів і додавання індикаторних барвників для перетворення інформації про наявність цільових нуклеїнових кислот у видимі зміни кольору [99, 100, 101].Примітно, що наночастинки золота широко використовуються в розробці колориметричних стратегій, і завдяки їх здатності викликати швидкі та значні зміни кольору зростає інтерес до розробки колориметричних платформ POCT для діагностики інфекційних захворювань in situ [102].За допомогою інтегрованого відцентрового мікрофлюїдного пристрою [103] патогени харчового походження в заражених пробах молока можуть бути автоматично виявлені на рівні 10 бактеріальних клітин, а результати можуть бути прочитані візуально протягом 65 хвилин (рис. 6c).
Методи магнітного зондування можуть точно виявляти аналіти за допомогою магнітних матеріалів, і в останні десятиліття спостерігався значний інтерес до застосувань POCT.Методи магнітного зондування мають деякі унікальні переваги, такі як дешеві магнітні матеріали, а не дорогі оптичні компоненти.Однак використання магнітного поля покращує ефективність детектування та скорочує час підготовки зразка [104].Крім того, результати магнітного зондування демонструють високу специфічність, чутливість і високе відношення сигнал/шум завдяки незначному магнітному фоновому сигналу біологічних зразків [105].Шарма та ін.інтегрував біосенсор на основі магнітного тунельного переходу в портативну платформу мікрочіпа.[106] для мультиплексного виявлення патогенів (рис. 6d).Біосенсори чутливо виявляють субнаномолярні нуклеїнові кислоти, виділені з патогенів.
Типовий метод виявлення сигналу.Концепція гіперлокалізованого виявлення Cas13a (адаптовано з [97]).b Графеновий нанобіосенсор FET у поєднанні з Lyme GroES scFv (адаптовано з [98]).c Колориметричні показання для мультиплексного виявлення харчових патогенів у відцентровому мікрофлюїдному чіпі: зразки № 1 і № 3 з цільовими патогенами та зразки № 2, № 4 і № 5 без цільових патогенів (адаптовано з [103]) .d Біосенсор на основі магнітного тунельного переходу, включаючи платформу, вбудований блокуючий підсилювач, блок керування та джерело живлення для генерації/отримання сигналу (адаптовано з [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polymethyl methacrylate
Незважаючи на відмінні характеристики вищевказаних методів виявлення, вони все ж мають недоліки.Ці методи порівнюються (таблиця 1), включаючи деякі додатки з деталями (плюси і мінуси).
З розвитком мікрофлюїдики, мікроелектромеханічних систем, нанотехнологій і матеріалознавства використання мікрофлюїдних чіпів для виявлення інфекційних захворювань постійно прогресує [55,96,107,108].Точне маніпулювання мініатюрним обладнанням і рідинами сприяє діагностичній точності та економічній ефективності.Тому для подальшого розвитку було докладено зусиль для оптимізації та модернізації чіпів, що призвело до створення різних мікрофлюїдних чіпів з різними структурами та функціями.Тут ми коротко представимо декілька поширених типів мікрофлюїдних платформ і порівняємо їхні характеристики (плюси та мінуси).Крім того, більшість наведених нижче прикладів зосереджені в основному на боротьбі з SARS-CoV-2.
LOCC є найпоширенішими мініатюрними складними аналітичними системами, і їх операції дуже мініатюрні, інтегровані, автоматизовані та розпаралелені від введення та підготовки зразка, контролю потоку та виявлення рідини [109, 110].З рідинами маніпулюють за допомогою ретельно розробленої геометрії та взаємодії багатьох фізичних ефектів, таких як градієнти тиску, капілярна дія, електродинаміка, магнітні поля та акустичні хвилі [111].LOCC демонструє чудові переваги у високопродуктивному скринінгу та множинному виявленні, завдяки високій швидкості аналізу, малому розміру вибірки, низькому енергоспоживанню та високій ефективності управління та експлуатації;однак пристрої LOCC дуже делікатні, а також виробництво, пакування та взаємодія.Однак мультиплексування та повторне використання стикаються з величезними труднощами [96].Порівняно з іншими платформами LOCC має унікальні переваги з точки зору максимальної різноманітності додатків і найкращої сумісності технологій, але її недоліки також очевидні, а саме висока складність і погана повторюваність.Залежність від зовнішніх насосів, які часто є громіздкими та дорогими, додатково обмежує їх використання в POCT.
Під час спалаху COVID-19 LOCC привернув багато уваги.У той же час є кілька нових чіпів, які поєднують кілька технологій.Наприклад, смартфони зараз широко використовуються як портативні аналітичні пристрої та мають великий потенціал для інтеграції LOCC.Sun та ін.[21] виготовили мікрофлюїдний чіп, який дозволяє мультиплексувати специфічні послідовності нуклеїнових кислот п’яти патогенів, включаючи SARS-CoV-2, за допомогою LAMP і проаналізували їх за допомогою смартфона протягом 1 години після закінчення реакції.Як інший приклад, Sundah et al.[112] створили молекулярний перемикач [каталітична ампліфікація за допомогою перемикача молекулярного переходу (CATCH)] для прямого та чутливого виявлення мішеней РНК SARS-CoV-2 за допомогою смартфонів. CATCH сумісний з портативним LOCC і забезпечує чудову продуктивність (приблизно 8 копій РНК/мкл; < 1 год при кімнатній температурі) [112]. CATCH сумісний з портативним LOCC і забезпечує чудову продуктивність (приблизно 8 копій РНК/мкл; < 1 год при кімнатній температурі) [112]. CATCH сумісний з портативним LOCC і забезпечує чудову продуктивність (примірно 8 копій РНК/мкл; < 1 год при кімнатній температурі) [112]. CATCH сумісний з портативним LOCC і забезпечує чудову пропускну здатність (приблизно 8 копій РНК/мкл; < 1 год при кімнатній температурі) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНК 拷贝/мкл；室温下< 1 小时）[112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНК 拷贝/мкл；室温下< 1 小时）[112]. CATCH сумісний з портативними LOCC і володіє високою продуктивністю (примірно 8 копій РНК/мкл; < 1 години при кімнатній температурі) [112]. CATCH сумісний з портативними LOCC і має чудову продуктивність (приблизно 8 копій РНК/мкл; < 1 години при кімнатній температурі) [112].Крім того, пристрої LOCC для молекулярної діагностики також використовують деякі рушійні сили, такі як вакуум, розтяжка та електричні поля.Кан та ін.[113] продемонстрували надшвидку ПЛР наноплазми на чіпі в режимі реального часу для швидкої та кількісної діагностики COVID-19 у польових умовах за допомогою вакуумного плазмонно-рідкого ПЛР-чіпа.Лі та ін.[114] згодом розробили мікрофлюїдний чіп із розтягуванням, який дозволив діагностувати COVID-19.Платформа використовує систему підсилення RT-LAMP, щоб визначити, чи є зразок якісно позитивним чи негативним.Згодом Ramachandran et al.[115] досягли відповідних градієнтів електричного поля, використовуючи ізотахофорез (ITP), метод селективного фокусування іонів, реалізований у мікрофлюїдіці.За допомогою ITP цільова РНК із сирих зразків мазка з носоглотки може бути автоматично очищена.Потім Рамачандран та ін.[115] Поєднання цього очищення ITP з аналізами LAMP і CRISPR, що підсилюють ITP, виявило SARS-CoV-2 у мазку з носоглотки людини та клінічних зразках приблизно за 35 хвилин.Крім того, постійно з’являються нові ідеї.Джадхав та ін.[116] запропонував діагностичну схему, засновану на спектроскопії раманівського розсіювання з покращеною поверхнею в поєднанні з мікрофлюїдним пристроєм, що містить або вертикально орієнтовані вуглецеві нанотрубки, вкриті золотом/сріблом, або одноразові мікро/нанотрубки з електроспінуванням.Мембранно-функціоналізовані вбудовані мікроканали фільтра одноразові.Пристрій адсорбує віруси з різних рідин/ексудацій організму, таких як слина, носоглотка та сльози.Таким чином, титр вірусу рясний, і вірус можна точно ідентифікувати за сигнатурою Рамана.
LOAD — це відцентрова мікрофлюїдна платформа, в якій усі процеси контролюються частотним протоколом, який обертає мікроструктуровану підкладку [110].Пристрій LOAD характеризується використанням відцентрової сили як важливої рушійної сили.На рідини також діють капілярні сили, сили Ейлера та Коріоліса.За допомогою пристрою центрифуги аналізи виконуються в безперервній рідинній роботі від радіального положення всередину до зовнішнього, що усуває потребу в додаткових зовнішніх трубках, насосах, приводах і активних клапанах.Одним словом, єдиний метод керування спрощує роботу.Сили, що діють на рідину в одному і тому ж мікрофлюїдному каналі на однаковій відстані від центру навантаження, рівні, що дозволяє повторити структуру каналу.Таким чином, обладнання LOAD є простішим і економнішим у проектуванні та виготовленні, ніж звичайне обладнання LOCC, тоді як реакції в значній мірі незалежні та розпаралелені;однак, через високу механічну міцність відцентрового обладнання, доступний матеріал для стружки обмежений, а невеликі обсяги складні.до автомобіля.У той же час більшість пристроїв LOAD призначені лише для одноразового використання, що є дорогим для великомасштабного виявлення [96, 117, 118, 119].
В останні десятиліття LOAD, який вважається одним із найперспективніших мікрофлюїдних пристроїв, привернув значну увагу дослідників і виробників.Таким чином, LOAD отримав широке визнання та використовувався для молекулярної діагностики інфекційних патогенів [120, 121, 122, 123, 124], особливо під час спалаху COVID-19.Наприклад, наприкінці 2020 року Ji et al.[60] продемонстрували прямий аналіз RT-qPCR для швидкого та автоматизованого паралельного виявлення SARS-CoV-2 та інфекцій грипу A і B у зразках мазків із горла.Потім Xiong та ін.[74] представили інтегровану в LAMP дискоїдну мікрофлюїдну платформу для швидкого, точного й одночасного виявлення семи респіраторних коронавірусів людини, включаючи SARS-CoV-2, протягом 40 хвилин.На початку 2021 року de Oliveira et al.[73] продемонстрували відцентровий мікрофлюїдний чіп з полістироловим тонером, який керується вручну ротатором пальця, для молекулярної діагностики COVID-19 RT-LAMP.Згодом Dignan et al.[39] представили автоматизований портативний центрифужний мікропристрій для очищення РНК SARS-CoV-2 безпосередньо зі зрізів буккального тампона.Медведь та ін.[53] запропонували вбудовану систему відбору проб аерозолю SARS-CoV-2 з обертовим мікрофлюїдним флуоресцентним чіпом невеликого об’єму з межею виявлення 10 копій/мкл і мінімальним порогом циклу 15 хвилин.Суарес та ін.[75] нещодавно повідомили про розробку інтегрованої модульної відцентрової мікрофлюїдної платформи для прямого виявлення РНК SARS-CoV-2 у термоінактивованих зразках мазка з носоглотки за допомогою LAMP.Ці приклади демонструють великі переваги та перспективи LOAD у молекулярній діагностиці COVID-19.
У 1945 році Мюллер і Клегг [125] вперше представили мікрофлюїдні канали на папері з використанням фільтрувального паперу та парафіну.У 2007 році група Whitesides [126] створила першу функціональну паперову платформу для тестування білка та глюкози.Папір став ідеальною підкладкою для мікрофлюідики.Папір має властиві такі властивості, як гідрофільність і пориста структура, відмінна біосумісність, легка вага, гнучкість, згортання, низька вартість, простота використання і зручність.Класичні µPAD складаються з гідрофільних/гідрофобних структур, побудованих на паперових підкладках.Залежно від тривимірної структури μPAD можна розділити на двовимірні (2D) і тривимірні (3D) μPAD.2D µPAD виготовляються шляхом формування гідрофобних меж для формування мікрофлюїдних каналів, тоді як 3D µPAD зазвичай виготовляються зі стопок шарів 2D мікрофлюїдного паперу, іноді за допомогою складання паперу, техніки ковзання, відкритих каналів і 3D-друку [96].Водні або біологічні рідини на μPAD в основному контролюються капілярною силою без зовнішнього джерела живлення, що полегшує попереднє зберігання реагентів, обробку зразків і мультиплексне виявлення.Однак точне керування потоком і мультиплексне виявлення перешкоджають недостатній швидкості виявлення, чутливості та можливості повторного використання [96, 127, 128, 129, 130].
Як незвичайна мікрофлюїдна платформа, μPAD широко популяризували та розробляли для молекулярної діагностики інфекційних захворювань, таких як ВГС, ВІЛ та SARS-CoV-2 [131, 132].Для вибіркового та чутливого виявлення ВГС Tengam et al.[133] розробили новий біосенсор на основі флуоресцентного паперу, використовуючи високоспецифічний зонд нуклеїнової кислоти на основі піролідинілового пептиду.Нуклеїнові кислоти ковалентно іммобілізуються на частково окисленому целюлозному папері шляхом відновного алкілування між аміногрупами та альдегідними групами, а виявлення ґрунтується на флуоресценції.Ці сигнали можна зчитувати спеціально виготовленим гаджетом з портативною флуоресцентною камерою в поєднанні з камерою мобільного телефону.Згодом Lu et al.[134] розробили гнучкий гнучкий електрод на основі нікелю/наночастинок золота/вуглецевих нанотрубок/полівінілового спирту металоорганічних каркасних композитів для виявлення мішені ВІЛ шляхом гібридизації ДНК з використанням метиленового синього як окисно-відновного індикатора ДНК.Нещодавно Chowdury та ін.[135] представили гіпотетичний дизайн платформи для тестування µPAD на місці надання медичної допомоги з використанням необробленої слини пацієнта в поєднанні з LAMP і портативною технологією візуалізації для виявлення аналіту COVID-19.
Випробування бічного потоку направляють рідини за допомогою капілярних сил і контролюють рух рідини за допомогою змочуваності та характеристик пористих або мікроструктурованих субстратів.Пристрої бічного потоку складаються із зразка, кон’югату, інкубатора та детектора, а також абсорбуючих прокладок.Молекули нуклеїнової кислоти в LFA розпізнають специфічні сполучні речовини, які попередньо зберігаються в місці зв’язування, і зв’язуються у вигляді комплексів.Коли рідина проходить через інкубаційні та детекторні пластини, комплекси захоплюються молекулами захоплення, розташованими на тестовій і контрольній лініях, показуючи результати, які можна прочитати неозброєним оком.Зазвичай LFA можна завершити за 2-15 хвилин, що швидше, ніж традиційне відкриття.Завдяки особливому механізму LFA вимагає мало операцій і не потребує додаткового обладнання, що робить його дуже зручним у використанні.Його легко виготовити та мініатюризувати, а вартість паперових підкладок нижча.Однак він використовується лише для якісного аналізу, а кількісне виявлення дуже складне, а здатність мультиплексування та пропускна здатність дуже обмежені, і за один раз можна виявити лише одну достатню кількість нуклеїнової кислоти [96,110,127].
Хоча більшість застосувань LFA зосереджено на імуноаналізі, використання LFA для молекулярної діагностики в мікрофлюїдних чіпах також є ефективним і популярним [136].У випадку вірусу гепатиту B, ВІЛ і SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] запропонували платформу наночастинок LFA з підвищенням конверсії та продемонстрували універсальність цієї мініатюрної та портативної платформи за допомогою чутливого та кількісного виявлення кількох мішеней, таких як нуклеїнова кислота HBV.Крім того, Fu et al.[138] продемонстрували новий LFA, заснований на раманівській спектроскопії з покращеною поверхнею, для кількісного аналізу ДНК ВІЛ-1 у низьких концентраціях.Для швидкого та чутливого виявлення SARS-CoV-2 Liu et al.[85] розробили мікрофлюїдний інтегрований аналіз бокового потоку RPA шляхом поєднання RT-RPA та універсальної системи виявлення бічного потоку в єдину мікрофлюідну систему.
Застосування різних мікрофлюїдних платформ залежить від конкретних досліджень, повною мірою використовуючи можливості та переваги платформ.Завдяки доступним за ціною клапанам, насосам і повітропроводам LOCC є найповнішою платформою для різноманітності застосувань і сумісності з великим простором для розвитку.Тому ми сподіваємось і рекомендуємо, щоб нові дослідження були проведені в LOCC як перша спроба та щоб умови були оптимізовані.Крім того, очікується, що в системі будуть виявлені та використані більш ефективні та точні методи.LOAD вирізняється точним керуванням рідинами з існуючих пристроїв LOCC і демонструє унікальні переваги в одиночних приводах за допомогою відцентрової сили без необхідності зовнішніх приводів, тоді як паралельні реакції можуть бути окремими та синхронізованими.Таким чином, у майбутньому LOAD стане основною мікрофлюїдною платформою з меншою кількістю ручних операцій і більш зрілими та автоматизованими технологіями.Платформа µPAD поєднує в собі переваги LOCC і матеріалів на паперовій основі для недорогої одноразової діагностики.Тому майбутній розвиток має бути зосереджений на зручних і відпрацьованих технологіях.Крім того, LFA добре підходить для виявлення неозброєним оком, обіцяючи зменшити споживання зразків і прискорити виявлення.Детальне порівняння платформ наведено в таблиці 2.
Цифровий аналіз розділяє зразок на багато мікрореакторів, кожен з яких містить дискретну кількість цільових молекул [139, 140].Цифрові аналізи пропонують значні переваги для виконання абсолютного кількісного визначення шляхом виконання тисяч паралельних біохімічних експериментів одночасно та окремо в мікронних відсіках, а не в безперервній фазі.У порівнянні з традиційною мікрофлюїдкою, компартментні реакції можуть зменшити об’єм зразка, підвищити ефективність реакції та легко інтегруватися з іншими аналітичними методами без необхідності використання каналів, насосів, клапанів і компактних конструкцій [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Наступні два методи використовуються в цифрових аналізах для досягнення рівномірного та точного розділення розчинів, включаючи реагенти та зразки, такі як клітини, нуклеїнові кислоти та інші частинки або молекули: (1) краплинні емульсії, що використовують нестабільність поверхні рідини;(2) поділ масиву здійснюється геометричними обмеженнями пристрою.У першому методі краплі, що містять реагенти та зразки в мікроканалах, можуть бути створені за допомогою пасивних методів, таких як прямотечія, перехресний потік, фокусування потоку, поетапне емульгування, мікроканальне емульгування та мембрани через сили в’язкого зсуву та емульгування зі зміною каналу.локалізації [143, 145, 146, 148, 149] або за допомогою активних методів [150, 151], які вводять додаткову енергію за допомогою електричного, магнітного, теплового та механічного контролю.В останньому підході найкраща однорідність об’єму рідини в мікрофлюїдних камерах поділяється шляхом збереження просторових структур однакового розміру, таких як мікроямки та поверхневі масиви [152,153,154].Примітно, що краплі є основними секціями потоку, якими також можна генерувати та маніпулювати на масивах електродів на основі цифрової мікрофлюїдики (DMF).Електрозмочування діелектриків є однією з найкраще вивчених теорій DMF, оскільки електрозмочування діелектриків дозволяє точно маніпулювати окремими краплями, керуючи формою рідини та асиметричними електричними сигналами, що проходять через різні сторони [141, 144].Основні операції з краплями в DMF включають сортування, розщеплення та злиття [151, 155, 156], які можуть бути застосовані в різних областях аналізу, особливо в молекулярному детектуванні [157, 158, 159].
Цифрове виявлення нуклеїнових кислот — це технологія молекулярної діагностики третього покоління після звичайної ПЛР і кількісної ПЛР у реальному часі (qPCR), паралельно з високопродуктивним секвенуванням і рідинною біопсією.В останні два десятиліття цифрові нуклеїнові кислоти стрімко розвиваються в галузі молекулярної діагностики інфекційних збудників [160, 161, 162].Абсолютна кількісна оцінка цифрового виявлення нуклеїнових кислот починається з упаковки зразків і реагентів в окремі компартменти, щоб гарантувати, що кожна цільова послідовність має однакову ймовірність потрапляння в кожен окремий компартмент.Теоретично кожній ділянці може бути присвоєно кілька цільових послідовностей, або може не існувати незалежної системи мікрореакцій.За допомогою різних механізмів чутливості, описаних вище, компартменти з мікробними цільовими послідовностями, які генерують сигнали вище певного порогу, можна візуалізувати неозброєним оком або за допомогою машини та позначати як позитивні, тоді як інші компартменти, які генерують сигнали нижче порогу, позначаються як позитивні .негативні, які роблять сигнал для кожної секції булевим.Таким чином, обчислюючи кількість створених компартментів і швидкість позитивних результатів після реакції, оригінальні копії досліджуваних зразків можна зіставити за допомогою формули розподілу Пуассона без необхідності стандартної кривої, яка потрібна для рутинних кількісних аналізів, таких як як КПЦР.[163] Порівняно з традиційними методами молекулярної діагностики цифрове виявлення нуклеїнових кислот має вищий ступінь автоматизації, вищу швидкість аналізу та чутливість, менше реагентів, менше забруднення, а також простіший дизайн і виробництво.З цих причин використання цифрових аналізів, особливо методів на основі крапель, для молекулярної діагностики, що поєднують методи ампліфікації та зчитування сигналу, було добре вивчено під час критичного спалаху SARS-CoV-2.Наприклад, Yin et al.[164] об’єднали краплинні цифрові та швидкі методи ПЛР для виявлення генів ORF1ab, N та РНКази P у SARS-CoV-2 у мікрофлюїдному чіпі.Примітно, що система змогла ідентифікувати позитивний сигнал протягом 115 секунд, що швидше, ніж звичайна ПЛР, що свідчить про її ефективність у виявленні на місці надання медичної допомоги (рис. 7a).Dong та ін.[165], Соу та ін.[157], Чен та ін.[166] і Альтері та ін.[167] також застосували краплинну цифрову ПЛР (ddPCR) для виявлення SARS-CoV-2 у мікрофлюїдній системі з вражаючими результатами.Для подальшого підвищення рівня виявлення Shen et al.[168] досягли зображення чіпа на основі ddPCR всього за 15 секунд без використання техніки зшивання зображень, що прискорило процес технології ddPCR від лабораторії до застосування.Застосовуються не тільки методи термічної ампліфікації, такі як ПЛР, але й методи ізотермічної ампліфікації для спрощення умов реакції та швидкої реакції.Лу та ін.[71] розробили SlipChip для аналізу крапель, здатний генерувати краплі різного розміру з високою щільністю за один крок і кількісно визначати нуклеїнові кислоти SARS-CoV-2 за допомогою цифрової LAMP (рис. 7b).Як технологія, що швидко розвивається, CRISPR також може відігравати важливу роль у цифровому виявленні нуклеїнових кислот за допомогою зручного колориметричного зображення без необхідності додаткового фарбування нуклеїнових кислот.Акерман та ін.розробив комбінаторну матричну реакцію для мультиплексної оцінки нуклеїнових кислот.[158] виявили 169 асоційованих з людиною вірусів, у тому числі SARS-CoV-2, у краплях, що містять реагенти для виявлення нуклеїнових кислот на основі CRISPR-Cas13, у мікролуночному аналізі (рис. 7c).Крім того, ізотермічне підсилення та технологію CRISPR можна використовувати в одній системі, щоб поєднати переваги обох.Парк та ін.[169] Цифровий аналіз CRISPR/Cas12a був розроблений у комерційному мікрофлюїдному чіпі для виявлення екстрагованого та вбитого теплом SARS-CoV-2 на основі одноетапного RT-RPA з коротшим і вищим виявленням сигнал-фон співвідношення часу., ширший динамічний діапазон і кращу чутливість (рис. 7d).Деякі описи цих прикладів наведено в таблиці 3.
Типова цифрова платформа для виявлення нуклеїнових кислот.a Робочий процес швидкої цифрової ПЛР складається з чотирьох ключових етапів: підготовки зразка, розподілу реакційної суміші, процесу ампліфікації та кількісного визначення мішені (адаптовано з [164]).b Схематичний показ аналізу крапель SlipChip для утворення крапель при високій щільності (адаптовано з [71]).c Діаграма робочого процесу CARMEN-Cas13 (адаптовано з [158]).d Огляд розширеного цифрового виявлення вірусів за допомогою CRISPR/Cas в одному контейнері (адаптовано з [169]).W/O вода в маслі, полідиметилсилоксан PDMS, ПЛР-полімеразна ланцюгова реакція, збір даних DAQ, пропорційна інтегральна похідна PID, комбінаторна матрична реакція CARMEN для мультиплексної оцінки нуклеїнових кислот, SARS-CoV-2, важкий гострий респіраторний синдром, коронавірус 2, RT Ампліфікація зворотної транскриптази рекомбінази полімерази-RPA, сигнал S/B у фоновому режимі
Час публікації: 15 вересня 2022 р
