Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Методи ферментативного близького маркування, засновані на активованих ефірах або феноксирадикалах, широко використовуються для картування субклітинних протеомів і білкових інтеракторів у живих клітинах.Однак активовані складні ефіри менш реакційноздатні, що призводить до широкого радіусу мічення, а феноксирадикали, що утворюються під час обробки перекисом, можуть заважати окисно-відновним шляхам.Тут ми повідомляємо про метод фотоактивації, залежної від маркування близькості (PDPL), розроблений шляхом генетичного зв’язування білка фотосенсибілізатора miniSOG з білком, що представляє інтерес.Під дією синього світла та під контролем часу експозиції утворюється синглетний кисень, а потім досягається просторово-часове позначення залишків гістидину аніліновим зондом.Ми демонструємо його високу точність за допомогою картування протеомів, специфічних для органел.Паралельне порівняння PDPL з TurboID показує більш специфічне та повне протеомне покриття PDPL.Далі ми застосували PDPL до асоційованого із захворюванням транскрипційного коактиватора BRD4 та E3 Parkin ligase та знайшли раніше невідомі взаємодіючі речовини.Шляхом скринінгу надекспресії було ідентифіковано два невідомі субстрати, Ssu72 і SNW1, для Parkin, чия деградація опосередкована шляхом убіквітування-протеасоми.
Точна характеристика білкових мереж лежить в основі багатьох фундаментальних клітинних процесів.Таким чином, високоточне просторово-часове відображення взаємодій білків забезпечить молекулярну основу для розшифровки біологічних шляхів, патології захворювання та порушення цих взаємодій для терапевтичних цілей.З цією метою дуже бажані методи, здатні виявляти тимчасові взаємодії в живих клітинах або тканинах.Мас-спектрометрія афінної очистки (AP-MS) історично використовувалася для ідентифікації партнерів зв’язування цікавих білків (POI).З розвитком кількісних методів протеоміки була створена Bioplex3.0, найбільша база даних білкових мереж на основі AP-MS.Хоча AP-MS є дуже потужним, етапи лізису та розведення клітин у робочому процесі спрямовані на слабкі та тимчасові зв’язувальні взаємодії та вводять артефакти після лізису, такі як хибні пари взаємодії, які не мають компартменталізації до лізису.
Для вирішення цих проблем були розроблені неприродні амінокислоти (UAA) з групами перехресного зшивання та платформи ферментативного сусіднього мічення (PL) (наприклад, APEX і BioID)5.Незважаючи на те, що метод UAA був успішно застосований у багатьох сценаріях і надає інформацію про прямі протеїнові адгезиви, все ще потрібна оптимізація місця введення UAA.Що більш важливо, це стехіометричний метод мічення, якому не вистачає каталітичного реверсування подій мічення.Навпаки, ферментативні методи PL, такі як метод BioID, зливають сконструйовану біотинлігазу з POI7, який згодом активує біотин з утворенням реакційноздатного проміжного ефіру біотиніл-AMP.Таким чином, фермент каталізує та вивільняє активовану «хмару» біотину, яка позначає проксимальні залишки лізину.Однак BioID вимагає більше 12 годин для отримання достатнього міченого сигналу, що виключає його використання з тимчасовим дозволом.Використовуючи спрямовану еволюцію на основі дріжджового дисплея, TurboID було розроблено на основі BioID, щоб бути більш ефективним, дозволяючи ефективне мічення біотином протягом 10 хвилин, дозволяючи вивчати більш динамічні процеси.Оскільки TurboID має високу активність, а рівень ендогенного біотину достатній для мічення на низькому рівні, фонове мічення стає потенційною проблемою, коли потрібне посилене та своєчасне мічення шляхом додавання екзогенного біотину.Крім того, активовані складні ефіри мають низьку реакційну здатність (t1/2 ~5 хв), що може призвести до великого радіусу мічення, особливо після насичення сусідніх білків біотином 5. В іншому підході генетичне злиття сконструйованої аскорбатпероксидази (тобто біотин- фенольні радикали та дозволяє позначати білки протягом однієї хвилини 9, 10. APEX широко використовується для ідентифікації субклітинних протеомів, мембранних білкових комплексів і цитозольних сигнальних білкових комплексів 11, 12. Однак потреба у високих концентраціях пероксидів може впливати на окисно-відновні білки або шляхи, порушуючи клітинні процеси.
Таким чином, новий метод, здатний генерувати більш реактивні види придушення міченого радіуса з високою просторовою та часовою точністю без значного порушення клітинних шляхів, буде важливим доповненням до існуючих методів. Серед реактивних видів синглетний кисень привернув нашу увагу через його короткий час життя та обмежений радіус дифузії (t1/2 < 0,6 мкс у клітинах)13. Серед реактивних видів синглетний кисень привернув нашу увагу через його короткий час життя та обмежений радіус дифузії (t1/2 < 0,6 мкс у клітинах)13. У середовищі активних форм наша увага притягує синглетний кислород із-за його короткого часу життя та обмеженого радіуса дифузії (t1/2 < 0,6 мкс у клітинах)13. Серед активних форм синглетний кисень привернув нашу увагу через короткий час життя та обмежений радіус дифузії (t1/2 < 0,6 мкс у клітинах)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 мкс）而引起了我们的注意13 1/2 < 0,6 мкс）而引起了我们的注意13 Серед активних форм наша увага привертає синглетний кислород із-за його короткого часу життя та обмеженого радіуса дифузії (t1/2 < 0,6 мкс у клітинах). Серед активних форм синглетний кисень привертає нашу увагу через короткий час життя та обмежений радіус дифузії (t1/2 < 0,6 мкс у клітинах).Повідомлялося, що синглетний кисень випадковим чином окислює метіонін, тирозин, гістидин і триптофан, роблячи його полярним 14,15 для приєднання до зондів на основі аміну або тіолу16,17.Хоча синглетний кисень використовувався для мічення РНК субклітинного компартменту, стратегії перепрофілювання ендогенних маркерів близькості POI залишаються невивченими.Тут ми представляємо платформу під назвою фотоактиваційно-залежне маркування близькості (PDPL), де ми використовуємо синє світло для освітлення POI, злитого з фотосенсибілізатором miniSOG, і запускаємо генерацію синглетного кисню для окислення проксимальних залишків, а потім модифікуємо аміни для окислення хімічних зондів у проміжні живі клітини..Ми протестували групу хімічних зондів, щоб максимізувати специфічність міток, і визначили місця модифікації за допомогою відкритого робочого процесу протеоміки.Паралельне порівняння PDPL з TurboID показує більш специфічне та повне протеомне покриття PDPL.Ми застосували цей підхід до органел-специфічних маркерів субклітинного протеома та загальної ідентифікації протеомів зв’язуючих партнерів для асоційованого з раком епігенетичного регуляторного білка BRD4 та асоційованої з хворобою Паркінсона Е3-лігази Паркіна, що підтвердило як відому, так і невідому мережу білків взаємодії..Здатність PDPL розпізнавати субстрати E3 у великих білкових комплексах представляє ситуацію, коли потрібне розпізнавання непрямих зв’язуючих речовин.Два невідомі субстрати паркіну, опосередковані протеасомою убіквітування, були підтверджені in situ.
Фотодинамічна терапія (PDT)19 і хромофорна лазерна інактивація (CALI)20, при яких світлове опромінення фотосенсибілізаторами генерує синглетний кисень, може інактивувати білки-мішені або викликати загибель клітин.Оскільки синглетний кисень є високореакційною речовиною з теоретичною відстанню дифузії близько 70 нм, можна контролювати просторово обмежене окислення навколо фотосенсибілізатора.Базуючись на цій концепції, ми вирішили використовувати синглетний кисень для досягнення точного мічення білкових комплексів у живих клітинах.Ми розробили хемопротеомний підхід PDPL для виконання чотирьох функцій: (1) каталізувати утворення активного синглетного кисню, подібно до ферментативного підходу PL;(2) забезпечувати маркування з розділенням часу після ініціювання світла;(3) шляхом зміни (4) Уникайте використання ендогенних кофакторів (таких як біотин) для зменшення фону або використовуйте сильно заважаючі екзогенні реагенти (такі як пероксиди), щоб мінімізувати вплив на клітини навколишнього середовища.
Фотосенсибілізатори можна розділити на дві категорії, включаючи флуорофори з низькою молекулярною масою (наприклад, бенгальська троянда, метиленовий синій)22 і генетично закодовані невеликі білки (наприклад, miniSOG, KillerRed)23.Для досягнення модульної конструкції ми розробили платформу PDPL першого покоління, додавши білки фотосенсибілізатора (PS) до POI24,25 (рис. 1a).При опроміненні синім світлом синглетний кисень окислює проксимальні нуклеофільні амінокислотні залишки, що призводить до полярності умполунга, яка є електрофільною і може далі реагувати з нуклеофілами амінного зонду16,17.Зонд розроблено з алкіновою рукояткою, що дозволяє клацати хімію та опускати вниз для визначення характеристик РХ/МС/МС.
Схематичне зображення мічення білкових комплексів, опосередкованих miniSOG.Під впливом синього світла клітини, що експресують miniSOG-POI, генерують синглетний кисень, який модифікує взаємодіючі білки, але не зв’язувальні білки.Проміжні продукти фотоокислення перехоплюються релейними мітками амінного хімічного зонда з утворенням ковалентних аддуктів.Алкінільна група на хімічному зонді дозволяє клацати хімію для збагачення шляхом витягування з подальшим кількісним визначенням РХ-МС/МС.b Хімічна структура амінних зондів 1-4.c Репрезентативний аналіз флуоресцентного гелю мітохондріальних локалізованих miniSOG-опосередкованих протеомних маркерів з використанням зондів 1-4 і відносного кількісного визначення на основі гелевої денситометрії.Співвідношення сигнал/фон хімічних зондів оцінювали за допомогою експериментів з негативним контролем, виключаючи синє світло, або з використанням клітин HEK293T без експресії miniSOG.n = 2 біологічно незалежні зразки.Кожна точка представляє біологічну копію.d Репрезентативне виявлення та кількісне визначення PDPL за допомогою оптимізованого зонда 3 у присутності або відсутності вказаних компонентів PDPL, таких як c.n = 3 біологічно незалежні проби.Кожна точка представляє біологічну копію.Центральні лінії та вуси представляють середнє значення та ± стандартне відхилення.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Конфокальне зображення синглетного кисню з далеко-червоним фарбуванням Si-DMA.Масштабна шкала: 10 мкм.Гелеві зображення та конфокальні експерименти були незалежно повторені принаймні двічі з подібними результатами.
Спочатку ми перевірили здатність зрілих фотосенсибілізаторів miniSOG26 і KillerRed23, стабільно експресованих у HEK293T, опосередковувати маркування пропаргіламіном протеома як хімічного зонда (додатковий рис. 1а).Аналіз флуоресценції гелю показав, що мічення всього протеома було досягнуто за допомогою miniSOG та опромінення синім світлом, тоді як видимого продукту мічення не спостерігалося з KillerRed.Щоб покращити співвідношення сигнал/фон, ми протестували набір хімічних зондів, що містять анілін (1 і 3), пропіламін (2) або бензиламін (4).Ми спостерігали, що самі клітини HEK293T мали вищий фоновий сигнал порівняно з відсутністю синього світла, можливо, через ендогенний рибофлавіновий фотосенсибілізатор, флавіновий мононуклеотид (FMN) 27 . Хімічні зонди на основі аніліну 1 і 3 дали кращу специфічність, причому HEK293T стабільно експресує miniSOG у мітохондріях, демонструючи >8-кратне збільшення сигналу для зонда 3, тоді як зонд 2, використаний у методі РНК-мічення CAP-seq, показує лише ~2,5- кратне збільшення сигналу, ймовірно, через різні переваги реактивності між РНК і білком (рис. 1b, c). Хімічні зонди на основі аніліну 1 і 3 дали кращу специфічність, причому HEK293T стабільно експресує miniSOG у мітохондріях, демонструючи >8-кратне збільшення сигналу для зонда 3, тоді як зонд 2, використаний у методі РНК-мічення CAP-seq, показує лише ~2,5- кратне збільшення сигналу, ймовірно, через різні переваги реактивності між РНК і білком (рис. 1b, c).Хімічні зонди на основі аніліну 1 і 3 показали кращу специфічність: HEK293T, який стабільно експресує miniSOG в мітохондріях, демонструє більш ніж 8-кратне збільшення сигналу для зонда 3, тоді як зонд 2, який використовується в методі маркування РНК CAP-seq, лише демонструє ~2,5-кратне збільшення сигналу, ймовірно, через різні переваги реактивності між РНК і білком (рис. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， ， hek293t 在 粒体 粒体 中 表达 表达 表达 ， 探针 3 的 增加 增加> 8 倍 ， 而 用 于 标记 方法 cap-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于РНК 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 表达 表达 表达 表达 探针 3 的 增加 增加> 8 倍 而 于 于 标记 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAХімічні зонди на основі аніліну 1 і 3 мали кращу специфічність, HEK293T стабільно експресував miniSOG у мітохондріях, а зонд 3 мав більш ніж 8-кратне збільшення сигналу, тоді як зонд 2 для методу маркування РНК CAP-seq показав лише ~2,5-кратне збільшення.у сигналі, ймовірно, через різні переваги реакції між РНК і білком (рис. 1b, c).Крім того, були протестовані ізомери зонду 3 і гідразинові зонди (зонди 5, 6, 7), що підтверджує оптимізацію зонда 3 (додаткова рис. 1b, c).Подібним чином аналіз флуоресценції в гелі виявив інші оптимізовані експериментальні параметри: довжину хвилі опромінення (460 нм), концентрацію хімічного зонда (1 мМ) і час опромінення (20 хв) (додаткова рис. 2a–c).Пропущення будь-якого компонента або кроку в протоколі PDPL призвело до значного зворотного сигналу до фону (рис. 1d).Примітно, що маркування білка було значно знижено в присутності азиду натрію або тролокса, які, як відомо, гасять синглетний кисень.Присутність D2O, який, як відомо, стабілізує синглетний кисень, посилює сигнал мічення.Щоб дослідити вплив інших активних форм кисню на маркування, було додано маніт і вітамін С для встановлення поглиначів гідроксильних і супероксидних радикалів, відповідно, 18, 29, але вони не зменшили маркування.Додавання H2O2, але не освітлення, не призвело до маркування (додатковий рис. 3a).Флуоресцентне зображення синглетного кисню за допомогою зондів Si-DMA підтвердило наявність синглетного кисню в дроті HEK293T-miniSOG, але не в оригінальному дроті HEK293T.Крім того, mitoSOX Red не міг виявити утворення супероксиду після освітлення (рис. 1e та додаткова рис. 3b) 30. Ці дані переконливо свідчать про те, що синглетний кисень є основним активним видом кисню, відповідальним за подальше протеомне маркування.Цитотоксичність PDPL оцінювали, включаючи опромінення синім світлом і хімічні зонди, і не спостерігали значної цитотоксичності (додатковий рис. 4а).
Щоб вивчити механізм мічення та забезпечити протеомну ідентифікацію білкових комплексів за допомогою LC-MS/MS, нам спочатку потрібно визначити, які амінокислоти модифіковані, і дельта-масу міток зонда.Повідомлялося, що метіонін, гістидин, триптофан і тирозин модифікуються синглетним киснем14,15.Ми інтегруємо робочий процес TOP-ABPP31 із неупередженим відкритим пошуком, який забезпечує обчислювальна платформа FragPipe на основі MSFragger32.Після модифікації синглетного кисню та мічення хімічним зондом проводили хімію клацання з використанням мітки відновлення біотину, що містить лінкер, що розщеплюється, з подальшим розтягуванням нейтравідином і розщепленням трипсином.Модифікований пептид, який все ще був зв’язаний зі смолою, був фоторозщеплений для аналізу РХ-МС/МС (рис. 2а та додаткові дані 1).Велика кількість модифікацій відбулася по всьому протеому з перерахованими понад 50 збігами пептидної карти (PSM) (рис. 2b).Дивно, але ми спостерігали лише модифікацію гістидину, ймовірно, через вищу реакційну здатність окисленого гістидину до анілінових зондів, ніж інших амінокислот.Відповідно до опублікованого механізму окислення гістидину синглетним киснем,21,33 запропонована дельта-масова структура +229 Да відповідає аддукту зонда 3 з 2-оксо-гістидином після двох окислень, тоді як +247 Да є продуктом гідролізу. +229 Да (додатковий рис. 5).Оцінка спектру MS2 показала високу надійність ідентифікації більшості іонів y та b, включаючи ідентифікацію модифікованих фрагментних іонів (y та b) (рис. 2в).Контекстний аналіз локальної послідовності PDPL-модифікованих гістидинів виявив помірну перевагу мотиву для невеликих гідрофобних залишків у положеннях ±1 (додаткова рис. 4b).У середньому було ідентифіковано 1,4 гістидину на білок, а місця розташування цих маркерів визначали за допомогою аналізу площі поверхні, доступної для розчинника (SASA) і відносної доступності розчинника (RSA) (додаткова фіг. 4c, d).
Неупереджений робочий процес для вивчення залишкової селективності за допомогою обчислювальної платформи FragPipe на базі MSFragger.Розщеплювані лінкери використовуються в хімії Click, щоб дозволити фоторозщеплення модифікованих пептидів зі смоли стрептавідину.Було розпочато відкритий пошук для виявлення численних модифікацій, а також відповідних залишків.b Призначте масу модифікацій, що відбуваються в протеомі.Пептидне картування PSM.c MS2 спектральна анотація сайтів гістидину, модифікованих зондом 3. Як репрезентативний приклад, ковалентна реакція із зондом 3 додала +229,0938 Да до модифікованої амінокислоти.d Аналіз мутацій, що використовується для перевірки маркерів PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) і PRDX1 (H10A, H81A, H169A) були трансфіковані плазмідами дикого типу для виявлення анти-Flag.e Синтетичний пептид реагував з очищеним miniSOG у присутності зонда 3, і відповідні продукти з Δm +247 і +229 були відзначені в спектрі РХ-МС.f Взаємодії між протеїнами in vitro, змодельовані за допомогою miniSOG-6xHis-tag і антитіл проти 6xHis.Антибіотин (стрептавідин-HRP) і антимишачий Вестерн-блот аналіз комплексів антитіл miniSOG-6xHis/анти-6xHis, помічених зондом 3, залежно від часу впливу світла.Мітки для окремих білків виражаються у відповідній молекулярній масі: легкий ланцюг антитіла LC, важкий ланцюг антитіла HC.Ці експерименти були незалежно повторені принаймні двічі з подібними результатами.
Для біохімічної перевірки місця мічення PRDX3 і PRDX1, ідентифіковані за допомогою мас-спектрометрії, замінили з гістидину на аланін і порівняли з диким типом у аналізах трансфекції.Результати PDPL показали, що мутація значно зменшила маркування (рис. 2d).Тим часом пептидні послідовності, ідентифіковані під час відкритого пошуку, були синтезовані та реагували in vitro з очищеним miniSOG у присутності зонда 3 і синього світла, даючи продукти зі зрушенням маси +247 та +229 Да при виявленні за допомогою РХ-МС (рис. 2e).).Щоб перевірити, чи можна позначити взаємодіючі проксимальні білки in vitro у відповідь на фотоактивацію miniSOG, ми розробили аналіз штучної близькості шляхом взаємодії між білком miniSOG-6xHis і моноклональним антитілом проти His in vitro (рис. 2f).У цьому аналізі ми очікували проксимального мічення важких і легких ланцюгів антитіл miniSOG.Насправді вестерн-блоти проти миші (що розпізнають важкі та легкі ланцюги міченого анти-6xHis антитіла) і стрептавідину продемонстрували сильне біотинілювання важкого та легкого ланцюгів.Примітно, що ми помітили аутобіотинілювання miniSOG завдяки тегу 6xHis і перехресним зв’язкам між легким і важким ланцюгами, що може бути пов’язано з раніше описаним розривом між проксимальною відповіддю на лізин і 2-оксо-гістидин.На закінчення ми робимо висновок, що PDPL змінює гістидин залежно від близькості.
Нашою наступною метою було охарактеризувати субклітинний протеом, щоб перевірити специфічність маркування in situ.Таким чином, ми стабільно експресували miniSOG в ядрі, мітохондріальному матриксі або зовнішній мембрані ER клітин HEK293T (рис. 3a).Аналіз флуоресценції гелю виявив велику кількість мічених смуг у трьох субклітинних місцях, а також різні схеми маркування (рис. 3b).Аналіз флуоресцентної візуалізації показав високу специфічність PDPL (рис. 3c).Робочий процес PDPL супроводжувався реакціями клацання з родаміновими барвниками для окреслення субклітинних протеомів за допомогою флуоресцентної мікроскопії, а сигнали PDPL були спільно локалізовані за допомогою DAPI, мітохондріальних трекерів або трекерів ER, що підтверджує високу точність PDPL.Порівняння PDPL з TurboID за допомогою вестерн-блоттингу на авідині показало, що PDPL було позначено точніше порівняно з відповідними контролями.В умовах PDPL з’явилося більше мічених смуг, що вказує на більше білків, мічених PDPL (додатковий рис. 6a-d).
Схематичне зображення опосередкованого miniSOG маркування протеома, специфічного для органел.miniSOG націлюється на мітохондріальний матрикс шляхом злиття з N-кінцевими 23 амінокислотами ЦОГ4 людини (міто-miniSOG), ядро через злиття з H2B (nucleus-miniSOG) і Sec61β через цитоплазматичну сторону мембрани ER (ER-miniSOG ).Показання включають гель-візуалізацію, конфокальне зображення та мас-спектрометрію.b Репрезентативні зображення гелю трьох профілів PDPL, специфічних для органел.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Репрезентативні конфокальні зображення клітин HEK293T, які стабільно експресують miniSOG з різними субклітинними локалізаціями, виявленими антитілом, позначеним V5 (червоним).Субклітинні маркери використовуються для мітохондрій і ER (зелений).Робочий процес PDPL включає виявлення мічених miniSOG (жовтий) субклітинних протеомів за допомогою Cy3-азидної хімічної реакції.Масштабна шкала: 10 мкм.d Вулканічні графіки PDPL-мічених протеомів у різних органелах, кількісно визначені за допомогою кількісного визначення без міток (n = 3 незалежні біологічні експерименти).Двосторонній t-критерій Стьюдента використовувався на графіках вулканів.HEK293T дикого типу використовували як негативний контроль. Значно змінені білки виділені червоним кольором (p <0,05 і >2-кратна різниця інтенсивності іонів). Значно змінені білки виділені червоним кольором (p <0,05 і >2-кратна різниця інтенсивності іонів). Значно змінені білки виділені червоним кольором (p < 0,05 і >2-кратна різниця в інтенсивності іонів). Значно змінені білки виділені червоним кольором (р <0,05 і >2-кратна різниця в інтенсивності іонів).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异＂).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значно змінені білки виділені червоним кольором (p < 0,05 і > 2-кратна розниця в іонному силі). Значно змінені білки виділені червоним кольором (p <0,05 і> 2-кратна різниця в іонній силі).Споріднені білки, важливі для HEK293T-miniSOG, але не важливі для HEK293T, показані зеленим кольором.e Аналіз специфічності протеомних наборів даних з експериментів d.Зверху позначено загальну кількість статистично значущих білків у кожній органелі (червоні та зелені точки).Гістограми показують білки, локалізовані в органелах на основі MitoCarta 3.0, аналізу GO та A. Ting et al.Люди.Окремі набори даних для мітохондрій, ядер і ER.Ці експерименти були незалежно повторені принаймні двічі з подібними результатами.Необроблені дані надаються у формі файлів необроблених даних.
Натхненний результатами гелю та візуалізації, кількісне визначення без міток було використано для кількісного визначення ідентифікованого протеома в кожній органелі (додаткові дані 2).Нетрансфікований HEK293T використовували як негативний контроль для віднімання фонових маркерів. Аналіз графіка вулкана показав значно збагачені білки (p < 0,05 і >2-кратна інтенсивність іонів), а також білки-одиночки, які присутні лише в лініях, що експресують miniSOG (рис. 3d, червоні та зелені точки). Аналіз графіка вулкана показав значно збагачені білки (p < 0,05 і >2-кратна інтенсивність іонів), а також білки-одиночки, які присутні лише в лініях, що експресують miniSOG (рис. 3d, червоні та зелені точки). Аналіз графіка вулкана показав значно збільшені білки (p <0, 05 і > 2-кратна інтенсивність іонів), а також одиночні білки, які присутні тільки в лініях, що виражають miniSOG (рис. 3d, червоні та зелені точки). Аналіз вулканічної ділянки показав значно збагачений білками (p<0,05 та >2-кратна інтенсивність іонів), а також окремі білки, які присутні лише в лініях, що експресують miniSOG (рис. 3d, червоні та зелені точки).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 强度 强度） 以及 仅 存 在于 在于 表达 表达 中 的 单一 蛋白质 图 图 3d 红色 绿色点）。。。。。。。。。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 在于 在于 表达 的 单一 （图 图 3d 红色 。。。 。。。）））））））））））））） Аналіз графіка вулкана виявив значно збільшені білки (p <0, 05 і> 2x іонна сила), а також окремі білки, присутні тільки в експресійній лінії miniSOG (червоні та зелені точки на рис. 3d). Аналіз вулканічної ділянки виявив значно збагачені білки (p<0,05 і >2x іонна сила), а також окремі білки, присутні лише в лінії експресії miniSOG (червоні та зелені крапки на рис. 3d).Об’єднавши ці дані, ми ідентифікували 1364, 461 та 911 статистично значущих білків ядерної, мітохондріальної та зовнішньої мембрани ER відповідно.Щоб проаналізувати точність PDPL з локалізованою органелою, ми використали MitoCarta 3.0, аналіз генної онтології (GO) та A. Ting et al.набір даних8 використовувався для мітохондрій, ядра та ER для перевірки специфічності органоїдів виявлених білків, що відповідає точності 73,4, 78,5 та 73,0% (рис. 3e).Специфічність PDPL підтверджує, що PDPL є ідеальним інструментом для ідентифікації специфічних для органел протеомів.Примітно, що субмітохондріальний аналіз ідентифікованих мітохондріальних білків показав, що захоплений протеом був в основному розподілений у матриксі та внутрішній мембрані (226 і 106 відповідно), що становить 91,7% (362) від загальної кількості ідентифікованих мітохондріальних білків.був додатково підтверджений високий рівень PDPL (додатковий рис. 7а).Подібним чином субнуклеарний аналіз показав, що захоплений протеом був в основному розподілений в ядрі, нуклеоплазмі та ядерці (додатковий рис. 7b).Ядерний протеомний аналіз із сигнальним пептидом ядерної локалізації (3xNLS) показав подібну точність до конструкції H2B (додатковий рис. 7c–h).Щоб визначити специфічність маркера PDPL, ядерний ламінін A був обраний як більш дискретно локалізовану пастку POI7.PDPL ідентифікував 36 значно збагачених білків, з яких 12 білків (30,0% включаючи ламін А) були добре охарактеризованими білками, що взаємодіють з ламіном А, анотованими базою даних String, з вищим відсотком, ніж метод BioID (122 білки) 28 з 28. , 22,9 %) 7. Наш метод ідентифікував менше білків, можливо, через обмежені області мічення, що стало можливим завдяки більш активному синглетному кисню.Аналіз GO показав, що ідентифіковані білки в основному розташовані в нуклеоплазмі (26), ядерній мембрані (10), ядерній мембрані (9) і ядерних порах (5).У сукупності ці ядерно-локалізовані білки становлять 80% збагачених білків, що додатково демонструє специфічність PDPL (додатковий рис. 8a–d).
Встановивши здатність PDPL виконувати маркування близькості в органелах, ми перевірили, чи можна використовувати PDPL для аналізу партнерів зв’язування POI.Зокрема, ми намагалися визначити PDPL-аналіз цитозольних білків, які вважаються більш складними мішенями, ніж їх мембранно-локалізовані аналоги через їх високодинамічний характер.Бромодомен і екстратермінальний (BET) білок BRD4 привернули нашу увагу своєю ключовою роллю в різних захворюваннях 35, 36.Комплекс, утворений BRD4, є коактиватором транскрипції та важливою терапевтичною мішенню.Регулюючи експресію факторів транскрипції c-myc і Wnt5a, BRD4 вважається ключовим чинником, що визначає гострий мієлоїдний лейкоз (ГМЛ), множинну мієлому, лімфому Беркітта, рак товстої кишки та запальні захворювання37,38.Крім того, деякі віруси, як-от папіломавірус, ВІЛ і SARS-CoV-236,39, націлені на BRD4 для регулювання вірусної та клітинної транскрипції.
Щоб відобразити взаємодію BRD4 за допомогою PDPL, ми поєднали miniSOG з короткою N- або C-кінцевою ізоформою BRD4.Протеомні результати показали високий ступінь перекриття між двома конструкціями (додаткова фіг. 9а).Ядерний протеом, ідентифікований за допомогою miniSOG-H2B, охоплює 77,6% білків, що взаємодіють з BRD4 (додатковий рис. 9b).Потім використовували різні часи освітлення (2, 5, 10, 20 хв) для налаштування радіуса маркера (рис. 4а та додаткові дані 3).Ми робимо висновок, що за коротших фотоперіодів PDPL в першу чергу позначатиме прямих зв’язуючих партнерів, тоді як триваліші періоди включатимуть білки, ідентифіковані під час коротших періодів фотоактивації, а також непрямі мішені в комплексах мічення.Насправді ми виявили сильне перекриття між суміжними точками часу (84,6% протягом 2 і 5 хвилин; 87,7% протягом 5 і 10 хвилин; 98,7% протягом 10 і 20 хвилин) (рис. 4b і додаткова рис. 9c).У всіх експериментальних групах ми виявили не лише самомаркування BRD4, але й кілька відомих цілей, таких як MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A та HMGB1, анотованих у базі даних рядків.Іонна сила цих мішеней пропорційна часу експозиції (рис. 4c і додаткова рис. 9d).GO-аналіз білків, ідентифікованих у 2-хвилинній групі, показав, що ідентифіковані білки були локалізовані в ядрі та брали участь у ремоделюванні хроматину та функції РНК-полімерази.Молекулярна функція білка була збагачена зв’язуванням хроматину або транскрипційною коактивацією, що відповідає функції BRD4 (рис. 4d).Аналіз взаємодії білка з підтримкою бази даних рядків виявив перший рівень непрямих взаємодій між взаємодіючими комплексами сімейства BRD4 та HDAC, такими як SIN3A, NCOR2, BCOR та SAP130 (рис. 4e та додатковий рис. 9e), що відповідає BRD4 та HDAC, що зв’язують ацетильовані гістони. ..Крім того, репрезентативні мішені, ідентифіковані за допомогою LC-MS/MS, включаючи Sin3A, NSUN2, Fus і SFPQ, були підтверджені вестерн-блоттингом (рис. 4f).Нещодавно було повідомлено, що коротка ізоформа BRD4 утворює ядра з властивостями розділення фаз рідина-рідина (LLPS).РНК-зв'язувальні білки Fus і SFPQ опосередковують LLPS різних клітинних процесів і були ідентифіковані тут як незареєстровані BRD4-зв'язувальні білки.Взаємодія між BRD4 і SFPQ була підтверджена експериментами ко-імунопреципітації (co-IP) (рис. 4g), що свідчить про інший механізм опосередкованого BRD4 розділення фази рідина-рідина, який заслуговує на подальше дослідження.У сукупності ці результати свідчать про те, що PDPL є ідеальною платформою для ідентифікації відомих взаємодіючих BRD4, а також невідомих зв’язуючих білків.
Схематичне зображення розмітки близькості BRD4, опосередкованої miniSOG, час впливу: 2, 5, 10 і 20 хв.b Перекривання білків, ідентифікованих у різний час освітлення.Збагачення білком, виявлене в HEK293T-miniSOG-BRD4, було статистично значущим порівняно з HEK293T дикого типу.c Інтенсивність іонів під час кількісного визначення немічених репрезентативних відомих BRD4-зв’язуючих білків протягом зазначеного часу експозиції.n = 3 біологічно незалежні проби.Дані представлені як середнє ± стандартне відхилення.d Генний онтологічний аналіз (GO) білків, ідентифікованих у 2-хвилинній групі.Наведено перші десять термінів GO.Бульбашки забарвлені відповідно до категорії термінів GO, а розмір бульбашок пропорційний кількості білків, знайдених у кожному терміні.e Струнковий аналіз білків, що взаємодіють з BRD4.Жовті кружечки — це прямий клей, а сірі — перший шар непрямого клею.Червоні лінії представляють експериментально визначені взаємодії, а сині лінії представляють прогнозовані взаємодії.f Репрезентативні мішені зв’язування BRD4, ідентифіковані в LC-MS/MS, були перевірені Вестерн-блоттингом.g Експерименти коімунопреципітації підтверджують взаємодію між SFPQ і BRD4.Ці експерименти були незалежно повторені принаймні двічі з подібними результатами.Необроблені дані надаються у формі файлів необроблених даних.
На додаток до ідентифікації незареєстрованих мішеней, пов’язаних з POI, ми припускаємо, що PDPL буде придатним для ідентифікації субстратів для ферментів, що вимагатиме характеристики білків непрямого зв’язування у великих комплексах для анотування незареєстрованих субстратів.Паркін (кодується PARK2) є лігазою E3, і відомо, що мутації в паркіні викликають аутосомно-рецесивну ювенільну хворобу Паркінсона (AR-JP)42.Крім того, паркін був описаний як необхідний для мітофагії (мітохондріальної аутофагії) та видалення активних форм кисню.Однак, хоча було виявлено кілька субстратів паркіну, роль паркіну в цьому захворюванні залишається незрозумілою.Щоб анотувати неохарактеризовані субстрати, PDPL тестували шляхом додавання miniSOG до N- або C-кінця паркіну.Клітини обробляли транспортером протонів карбонілціаніду м-хлорфенілгідразоном (CCCP) для активації паркіну за допомогою шляху PINK1-Parkin.Порівняно з нашими результатами BRD4 PDPL, злиття N-кінця паркіна виявило більший набір цільових білків, хоча він охоплював більшу частину С-кінця (177 з 210) (рис. 5a, b і додаткові дані 4).результат узгоджується зі звітами про те, що N-кінцеві мітки можуть аномально активувати Parkin44.Дивно, але в наших даних з опублікованими результатами AP-MS для Parkin43 було лише 18 білків, що перекриваються, ймовірно, через відмінності між клітинними лініями та робочими процесами протеоміки.На додаток до чотирьох відомих білків (ARDM1, HSPA8, PSMD14 і PSMC3), ідентифікованих двома методами (рис. 5c)43.Для подальшої перевірки результатів РХ-МС/МС використовували обробку PDPL і наступний Вестерн-блот для порівняння результатів аналізу батьківських клітин HEK293T і стабільної N-кінцевої лінії паркіна.Раніше невідомі мішені CDK2, DUT, CTBP1 і PSMC4 були протестовані з відомим сполучним речовиною DNAJB1 (рис. 5d).
Вулканічний графік білків, що взаємодіють з паркінами, у клітинах HEK293T зі стабільно експресованим miniSOG, злитим з N- або C-кінцем паркіну (n = 3 незалежні біологічні експерименти).Двосторонній t-критерій Стьюдента використовувався на графіках вулканів.HEK293T використовували як негативний контроль. Значно змінені білки виділені червоним кольором (p <0,05 і >2-кратна різниця інтенсивності іонів). Значно змінені білки виділені червоним кольором (p <0,05 і >2-кратна різниця інтенсивності іонів). Значно змінені білки виділені червоним кольором (p < 0,05 і >2-кратна різниця в інтенсивності іонів). Значно змінені білки виділені червоним кольором (р <0,05 і >2-кратна різниця в інтенсивності іонів).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异＂).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значно змінені білки виділені червоним кольором (p < 0,05 і > 2-кратна розниця в іонному силі). Значно змінені білки виділені червоним кольором (p <0,05 і> 2-кратна різниця в іонній силі).Споріднені білки, важливі для HEK293T-miniSOG, але не важливі для HEK293T, показані зеленим кольором.b Діаграма Венна, що показує білки, що перекриваються між N-кінцевими та C-кінцевими конструкціями.N-кінцеві мітки можуть аномально активувати паркін і призвести до більш розпізнаваних білків.c Діаграма Венна, що показує білки, що перекриваються між PDPL і AP-MS.Перераховано відомі взаємодіючі речовини, включаючи 4 з 18 білків, що перекриваються, і 11 з 159 білків, спеціально визначених у PDPL.d Репрезентативні мішені, визначені за допомогою LC-MS/MS, перевіряли Вестерн-блоттингом.e Ssu72 і SNW1 були ідентифіковані як незареєстровані субстрати паркіну.Ці білкові плазміди, помічені FLAG, трансфікували в HEK293T і HEK293T-Parkin-miniSOG з подальшою обробкою CCCP у різні моменти часу.Деградація була більш вираженою в лінії гіперекспресії Паркіна.f Використовуючи інгібітор протеасоми MG132, було підтверджено, що процес деградації Ssu72 і SNW1 опосередковується убіквітуванням протеасоми.Ці експерименти були незалежно повторені принаймні двічі з подібними результатами.Необроблені дані надаються у формі файлів необроблених даних.
Примітно, що білки, ідентифіковані PDPL, повинні включати білки, що зв’язують паркін, та їх субстрати.Щоб виявити незареєстровані субстрати паркіна, ми відібрали сім ідентифікованих білків (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 і SNW1) і трансфікували плазміди, щоб піддати ці гени нормальному HEK293T і стабільно експресувати HEK293T miniSOG-Parkin з подальшою обробкою CCCP.Рівні білків Ssu72 і SNW1 були значно знижені в стабільній лінії miniSOG-Parkin (рис. 5e).Обробка CCCP протягом 12 годин призвела до найбільш значної деградації обох субстратів.Щоб дослідити, чи регулюється деградація Ssu72 і SNW1 убіквітуванням протеасоми, був доданий інгібітор протеасоми MG132 для інгібування активності протеасом, і фактично ми виявили, що процес їх деградації був інгібований (рис. 5f).Додаткові несубстратні мішені були підтверджені як інтерактори Паркіна за допомогою вестерн-блоттингу (додатковий рис. 10), який показав узгоджені результати з РХ-МС/МС.Підсумовуючи, інтеграція робочого процесу PDPL із перевіркою трансфекції цільового білка дозволяє ідентифікувати незареєстровані субстрати лігази E3.
Ми розробили загальну платформу маркування близькості, яка дозволяє ідентифікувати взаємодіючі POI у просторі та часі.Платформа заснована на фотосенсибілізуючому білку miniSOG, який становить лише близько 12 кДа, що становить менше половини розміру зрілого ферменту APEX2 (27 кДа) і на третину розміру TurboID (35 кДа).Менший розмір має значно розширити діапазон застосувань для вивчення малих білкових інтерактомів.Для збільшення квантового виходу синглетного кисню та розширення чутливості цього підходу необхідні подальші дослідження додаткових фотосенсибілізаторів, будь то генетично закодовані білки чи малі молекули.Для поточної версії miniSOG висока часова роздільна здатність може бути досягнута за допомогою синього підсвічування для активації маркерів наближення.Крім того, більший час експозиції вивільняє більшу «хмару» синглетного кисню, що призводить до модифікації більш дистальних залишків гістидину, збільшення радіуса мічення та можливості точного налаштування просторової роздільної здатності PDPL.Ми також протестували сім хімічних зондів, щоб збільшити співвідношення сигнал/фон, і дослідили молекулярний механізм цього підходу.Робочий процес TOP-ABPP у поєднанні з неупередженим відкритим пошуком підтвердив, що модифікації відбулися лише в гістидинах і не спостерігалося узгодженого мікрооточення для збільшення модифікацій гістидину, за винятком помірної переваги гістидинів в області петлі.
PDPL також використовувався для характеристики субклітинних протеомів зі специфічністю протеома та охопленням, принаймні порівнянним з іншими методами близького маркування та методами хімічного зондування, специфічними для органел.Маркери близькості також були успішно використані для характеристики поверхневих, лізосомальних і асоційованих із секретомами протеомів46,47.Ми вважаємо, що PDPL буде сумісний із цими субклітинними органелами.Крім того, ми кинули виклик PDPL, визначивши мішені для зв’язування цитозольного білка, які є більш складними, ніж мембранно-зв’язані білки, через їх динамічні властивості та участь у більш часових взаємодіях.PDPL було застосовано до двох білків, транскрипційного коактиватора BRD4 та асоційованої із захворюванням лігази E3 Parkin.Ці два білки були обрані не тільки через їх основні біологічні функції, але також через їх клінічну значимість і терапевтичний потенціал.Для цих двох POI було визначено відомих зв’язуючих партнерів, а також незареєстровані цілі.Примітно, що асоційований із розділенням фаз білок SFPQ підтверджено ко-ІП, що може вказувати на новий механізм, за допомогою якого BRD4 (коротка ізоформа) регулює LLPS.У той же час ми вважаємо, що ідентифікація підкладок Паркіна є сценарієм, у якому потрібна ідентифікація непрямих адгезивів.Ми ідентифікували два неідентифіковані субстрати паркіну та підтвердили їхню деградацію вздовж шляху убіквітування-протеасоми.Нещодавно була розроблена стратегія захоплення на основі механізму для виявлення субстратів гідролази шляхом захоплення їх ферментами.Хоча це дуже потужний метод, він не підходить для аналізу субстратів, які беруть участь в утворенні великих комплексів, і вимагає утворення ковалентних зв’язків між ферментом і субстратом.Ми очікуємо, що PDPL можна розширити для вивчення інших білкових комплексів і сімейств ферментів, таких як сімейства деубіквітіназ і металопротеаз.
Розроблено нову форму miniSOG під назвою SOPP3 з покращеним виробництвом синглетного кисню.Ми порівняли miniSOG з SOPP3 і виявили покращену продуктивність маркування, хоча співвідношення сигнал/шум залишилося незмінним (додатковий рис. 11).Ми припустили, що оптимізація SOPP3 (наприклад, шляхом спрямованої еволюції) призведе до більш ефективних білків-фотосенсибілізаторів, які вимагають коротшого часу освітлення і, таким чином, дозволять фіксувати більш динамічні клітинні процеси.Примітно, що поточна версія PDPL обмежена клітинним середовищем, оскільки вона вимагає освітлення синім світлом і не може проникати глибоко в тканини.Ця особливість виключає його використання в дослідженнях на тваринних моделях.Однак поєднання оптогенетики з PDPL може дати можливість для дослідження тварин, особливо в мозку.Крім того, інші розроблені інфрачервоні фотосенсибілізатори також усувають це обмеження.На даний момент ведуться дослідження в цій області.
Лінія клітин HEK293T була отримана від ATCC (CRL-3216).Клітинна лінія дала негативний результат на мікоплазмену інфекцію та була культивована в DMEM (Thermo, #C11995500BT) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (FBS, Vistech, #SE100-B) і 1% пеніциліну/стрептоміцину (Hyclone, #SV30010).вирощений в.
3-амінофенілен (зразок 3) і (4-етинілфеніл)метанамін (зразок 4) були придбані у Bidepharm.Пропіламін (зонд 2) був придбаний у Energy-chemicals.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (зонд 1) був синтезований згідно з опублікованими методами.
У додатковій таблиці 1 перераховані генетичні конструкції, використані в цьому дослідженні.Послідовності miniSOG і KillerRed були клоновані з дарової плазміди від P. Zou (Пекінський університет).Послідовність націлювання на мітохондріальний матрикс була отримана з 23 N-кінцевих амінокислот COX4 і клонована у вказані вектори за допомогою збірки Gibson (Beyotime, #D7010S).Для націлювання на мембрану та ядро ендоплазматичного ретикулуму ДНК людини SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L), ампліфікована за допомогою ПЛР з бібліотеки кДНК клітин HEK293T, і ДНК H2B (надана D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) і клонований, як зазначено вище.Якщо не вказано інше, інші білкові гени, використані для трансфекції та конструювання стабільних клітинних ліній, були ампліфіковані методом ПЛР з бібліотеки кДНК клітин HEK293T.G3S (GGGS) і G4S (GGGGS) використовували як лінкери між білком приманки та miniSOG.До цих злитих конструкцій було додано тег епітопу V5 (GKPIPNPLLGLDST).Для експресії у ссавців і створення стабільної лінії клітин злиту конструкцію miniSOG субклонували у лентивірусний вектор pLX304.Для бактеріальної експресії miniSOG клонували у вектор pET21a, позначений 6xHis на С-кінці.
Клітини HEK293T висівали по 2,0 x 105 клітин на лунку в шестилункові планшети та трансфікували через 24 години рекомбінантними лентивірусними плазмідами (2,4 мкг pLX304) і плазмідами для упаковки вірусів (1,5 мкг psPAX2 і 1,2 мкг pMD2.G) з використанням Lipo8000 (Beyotime). , #C0533), близько 80% злиття.Після нічної трансфекції середовище змінювали та інкубували ще 24 години.Збір вірусу проводили через 24, 48 і 72 години.Перед зараженням клітинних ліній-мішеней вірусне середовище фільтрували через фільтр 0,8 мкм (Merck, #millex-GP) і додавали полібрен (Solarbio, #H8761) до концентрації 8 мкг/мл.Через 24 години клітинам дозволили відновитися шляхом зміни середовища.Клітини відбирали з використанням 5 мкг/мл бластицидину (Solarbio, #3513-03-9) для перших трьох пасажів як менш суворий відбір.Потім використовували 20 мкг/мл як більш сувору схему для наступних трьох пасажів.
Клітини висівали в 12-лункові камери (Ibidi, #81201) з щільністю приблизно 20000 клітин на лунку.Щоб покращити адгезію клітин HEK293T, додайте 50 мкг/мл фібронектину (Corning, #356008), розведеного у фосфатно-сольовому буфері (PBS, Sangon, #B640435) при 37°C.Камери попередньо обробляли протягом 1 години, а потім видаляли PBS.Через 24 години клітини один раз промивали PBS, інкубували з 1 мМ зондом 3 у свіжому збалансованому сольовому розчині Хенкса (HBSS, Gibco, #14025092) протягом 1 години при 37°C, а потім інкубували з синім світлодіодом (460 нм). ).) опромінювали протягом 10 хв при кімнатній температурі.Після цього клітини двічі промивали PBS і фіксували 4% формальдегідом у PBS (Sangon, #E672002) протягом 15 хвилин при кімнатній температурі.Надлишок формальдегіду видаляли з фіксованих клітин тричі промиванням PBS.Потім клітини пермеабілізували 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) у PBS і промивали 3 рази PBS.Потім вийміть камеру та додайте до кожного зразка 25 мкл реакційної суміші, яка містить 50 мкМ Cy3-азиду (Aladdin, #C196720), 2 мМ CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 мМ BTTAA (Confluore, #BDJ-4). і 0,5 мг/мл аскорбату натрію (Aladdin, № S105024) та інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі.Після миттєвої реакції клітини шість разів промивали PBS, що містить 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST), а потім блокували 5% BSA (Abcone, #B24726) у PBST протягом 30 хвилин при кімнатній температурі.
Для колокалізаційного імунного фарбування клітини інкубували з первинними антитілами відповідно до вказаних умов: мишачі анти-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), кролячі анти-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), кроляче поліклональне анти-кальнексинове антитіло (1:500, Abcam, #ab22595) або кроляче анти-ламінове A/C моноклональне антитіло (1:500; CST, #2032) при 4 °C протягом ночі.Після 3-разового промивання PBST клітини інкубували з вторинними антитілами: козячим анти-кролячим Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034), розведеним 1:1000, козячим анти-мишачим Alexa Fluor 594 (CST, #8889), розведеним 1:1000.розведення Розвести при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.Потім клітини промивали 3 рази PBST і контрастно фарбували DAPI (Thermo, #D1306) у PBS протягом 10 хвилин при кімнатній температурі.Після 3 промивань PBS клітини запечатували в 50% гліцерині (Sangon, #A600232) у PBS для візуалізації.Імунофлуоресцентні зображення були отримані за допомогою конфокального мікроскопа ZEISS LSM 900 Airyscan2 і програмного забезпечення ZNE 3.5.
Для флуоресцентного зображення синглетного кисню клітини двічі промивали буфером Хенкса HEPES перед додаванням 100 нМ Si-DMA у буфер Хенкса HEPES (DOJINDO, #MT05).Після впливу світла клітини інкубували в CO2-інкубаторі при 37°C протягом 45 хвилин.Потім клітини двічі промивали буфером Хенкса HEPES і контрастно фарбували Hoechst у буфері Хенкса HEPES протягом 10 хвилин при кімнатній температурі та візуалізували за допомогою конфокального мікроскопа ZEISS LSM 900., #M36008) у буфері HBSS, що містить кальцій і магній.Після впливу світла або доксорубіцину (MCE, #HY-15142A) клітини інкубували в CO2-інкубаторі при 37°C протягом 10 хвилин, двічі промивали буфером HBSS та інкубували з Hoechst в буфері HBSS при кімнатній температурі.хвилин.Доксорубіцин використовували як позитивний контроль зонда, де клітини обробляли 20 мкМ доксорубіцину в HBSS, що містить 1% BSA, протягом 30 хвилин.Імунофлуоресцентні зображення були отримані за допомогою конфокального мікроскопа Zeiss LSM 900.
Клітини HEK293T, що стабільно експресують mito-miniSOG, висівали з щільністю приблизно 30% у чашки діаметром 15 см.Через 48 годин, коли було досягнуто ~80% конфлюентності, клітини промивали один раз PBS, інкубували з 1 мМ зондом 3 у свіжому буфері HBSS протягом 1 години при 37°C, а потім освітлювали синім світлодіодом протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. температура..Після цього клітини двічі промивали PBS, очищали та ресуспендували в крижаному буфері PBS, що містить інгібітори протеази без EDTA (MCE, #HY-K0011).Клітини лізували шляхом обробки ультразвуком наконечника протягом 1 хвилини (1 секунда ввімкнено та 1 секунда вимкнено при 35% амплітуді).Отриману суміш центрифугували при 15871xg протягом 10 хвилин при 4°C для видалення залишків, і концентрацію супернатанту доводили до 4 мг/мл за допомогою набору для аналізу білка BCA (Beyotime, #P0009).Змішайте 1 мл вищезазначеного лізату з 0,1 мМ біотин-азиду, що розкладається фото (Confluore, #BBBD-14), 1 мМ TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 мМ ліганду TBTA (Aladdin, #T162437) і 1 мМ CuSO4 інкубатора з дном обертання протягом 1 години при кімнатній температурі.Після миттєвої реакції додайте суміш до попередньо змішаного розчину (MeOH:CHCl3:H2O = 4 мл:1 мл:3 мл) у скляному флаконі на 10 мл.Зразки змішували і центрифугували при 4500 g протягом 10 хвилин при кімнатній температурі.Нижній і верхній розчини відкидали, осад двічі промивали 1 мл метанолу і центрифугували при 15871×g протягом 5 хвилин при 4°C.Додайте 1 мл 8 М сечовини (Aladdin, № U111902) у 25 мМ бікарбонату амонію (ABC, Aladdin, № A110539), щоб розчинити осад.Зразки відновлювали 10 мМ дитіотреїтолу (Sangon, #A100281 у 25 мМ ABC) протягом 40 хвилин при 55°C з подальшим додаванням 15 мМ свіжого йодацетаміду (Sangon, #A600539) при кімнатній температурі в темряві.Алкілування протягом 30 хв..Додатково додавали 5 мМ дитіотреїтолу, щоб зупинити реакцію.Приготуйте приблизно 100 мкл агарозних кульок NeutrAvidin (Thermo, #29202) для кожного зразка, промиваючи 3 рази 1 мл PBS.Вищезазначений розчин протеома розбавляли 5 мл PBS та інкубували з попередньо промитими агарозними кульками NeutrAvidin протягом 4 годин при кімнатній температурі.Потім кульки промивали 3 рази 5 мл PBS, що містить 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 рази 5 мл PBS, що містить 1М сечовину, і 3 рази 5 мл ddH2O.Потім гранули збирали центрифугуванням і ресуспендували в 200 мкл 25 мМ ABC, що містить 1 М сечовину, 1 мМ CaCl 2 (Macklin, #C805228) і 20 нг/мкл трипсину (Promega, #V5280).Трипсинізувати протягом ночі при 37°C з обертанням.Реакцію зупиняли додаванням мурашиної кислоти (Thermo, # A117-50) до досягнення рН 2-3.Намистини промивали 3 рази 1 мл PBS, що містить 0,2% SDS, 3 рази 1 мл PBS, що містить 1 М сечовину, а потім 3 рази 1 мл дистильованої води.Модифіковані пептиди вивільняли шляхом світлового лізису (365 нм) протягом 90 хвилин з використанням 200 мкл 70% MeOH.Після центрифугування супернатант збирали.Потім кульки промивали один раз 100 мкл 70% MeOH і супернатанти об’єднували.Зразки сушили у вакуумному концентраторі Speedvac і зберігали при -20°C до аналізу.
Для ідентифікації та кількісного визначення пептидів, модифікованих синглетним киснем, зразки повторно розчиняли в 0,1% мурашиної кислоти і 1 мкг пептидів аналізували за допомогою мас-спектрометра Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, оснащеного нано джерелом ESI від Tune і Xcalibur від постачальника програмного забезпечення 4.3.Зразки розділяли на капілярній колонці з внутрішньою упаковкою 75 мкм × 15 см з матеріалом C18 3 мкм (ReproSil-pur, #r13.b9.) і підключали до системи EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Пептиди розділяли за допомогою лінійної 95-хвилинної градієнтної хроматографії від 8% розчинника B до 50% розчинника B (A = 0,1% мурашиної кислоти у воді, B = 0,1% мурашиної кислоти у 80% ацетонітрилу), потім лінійно збільшували до 98% B min за 6 хв при швидкості потоку 300 нл/хв.Orbitrap Fusion Lumos збирає дані поперемінно між повним скануванням MS і скануванням MS2 залежно від даних.Напруга розпилення була встановлена на рівні 2,1 кВ, а температура капіляра для транспортування іонів становила 320°C.MS-спектри (350-2000 m/z) збирали з роздільною здатністю 120 000, AGC 4 × 105 і максимальним часом введення 150 мс.10 найпоширеніших багатозарядних прекурсорів у кожному повному скануванні були фрагментовані за допомогою HCD з нормалізованою енергією зіткнення 30%, квадрупольним вікном ізоляції 1,6 m/z і роздільною здатністю 30 000.Мішень AGC для тандемної мас-спектрометрії з використанням 5×104 і максимальним часом введення 150 мс.Динамічний виняток встановлено на 30 секунд. Невіднесені іони або іони із зарядом 1+ і >7+ були відхилені для MS/MS. Невіднесені іони або іони із зарядом 1+ і >7+ були відхилені для MS/MS. Неназначені іони або іони із зарядом 1+ і >7+ були відхилені для МС/МС. Невіднесені іони або іони із зарядом 1+ і >7+ були відхилені для MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。. Неуказані іони або іони з зарядами 1+ і >7+ були відхилені для МС/МС. Невизначені іони або іони із зарядами 1+ і >7+ були відхилені для MS/MS.
Необроблені дані обробляються за допомогою обчислювальної платформи FragPipe на основі MSFragger.Зміщення маси та відповідні амінокислоти визначали за допомогою алгоритму відкритого пошуку з допустимим відхиленням маси попередника від -150 до 500 Да.Потім модифіковані пептиди ідентифікували за допомогою модифікацій гістидину з приростом маси +229,0964 і +247,1069 Да в PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Клітини, що стабільно експресують злитий ген miniSOG, поміщали в чашки діаметром 6 см.Після досягнення ~80% злиття клітини один раз промивали HBSS (Gibco, #14025092), потім інкубували з хімічними зондами в HBSS протягом 1 години при 37°C і освітлювали синім світлом.Світлодіод 10 Вт протягом 20 хвилин при кімнатній температурі.Щоб визначити, який тип активних форм кисню бере участь у PDPL, 0,5 мМ вітаміну С (MCE, #HY-B0166), 5 мМ Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 мМ маніту (Energy Chemical, #69-65-8), 100 мкМ H2O2, 10 мМ NaN3 додавали до клітин як добавки.Після промивання холодним PBS клітини зіскрібали, збирали в центрифужні пробірки на 1,5 мл і обробляли ультразвуком за допомогою наконечника протягом 1 хвилини в 200 мкл PBS з 1x інгібітором протеази без EDTA (1 с і 1 с без, амплітуда 35%).Отриману суміш центрифугували при 15871 × g протягом 10 хвилин при 4 °C і концентрацію супернатанту доводили до 1 мг/мл за допомогою набору для аналізу білка BCA.Приблизно 50 мкл вищезазначеного лізату інкубували з 0,1 мМ родаміназиду (Aladdin, № T131368), 1 мМ TCEP, 0,1 мМ ліганду TBTA та 1 мМ CuSO4 протягом 1 години при кімнатній температурі з обертанням знизу вгору.Після реакції клацання проводили осадження ацетоном шляхом додавання 250 мкл попередньо охолодженого ацетону до зразків, інкубування при -20°C протягом 20 хвилин і центрифугування при 6010×g протягом 10 хвилин при 4°C.Зберіть осад і кип’ятіть у 50 мкл 1x буфера Леммлі протягом 10 хвилин при 95 °C.Потім зразки аналізували на довгих гелях SDS-PAGE і візуалізували за допомогою системи обробки зображень Bio-rad ChemiDoc MP Touch із програмним забезпеченням Image Lab Touch.
Експресію та очищення рекомбінантного білка miniSOG-6xHis проводили, як описано раніше.Коротко, клітини E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) трансформували pET21a-miniSOG-6xHis, а експресію білка індукували 0,5 мМ IPTG (Sangon, #A600168).Після лізису клітин білки очищали за допомогою агарозних кульок Ni-NTA (MCE, № 70666), діалізували проти PBS і зберігали при –80°C.
Для аналізу близькості мітки in vitro на основі антитіл змішайте 100 мкМ очищений miniSOG, 1 мМ зонд 3 і 1 мкг мишачого моноклонального антитіла проти мітки (TransGen, #HT501-01) у PBS до загального реакційного об’єму 50 мкл..Реакційну суміш опромінювали синім світлодіодним світлом протягом 0, 2, 5, 10 і 20 хвилин при кімнатній температурі.Суміш інкубували з 0,1 мМ біотин-PEG3-азидом (Aladdin, #B122225), 1 мМ TCEP, 0,1 мМ лігандом TBTA і 1 мМ CuSO4 протягом 1 години при кімнатній температурі на шейкері, що рухається вгору.Після швидкої реакції додайте 4x буфер Леммлі безпосередньо до суміші та кип’ятіть при 95°C протягом 10 хв.Зразки аналізували на SDS-PAGE гелі та аналізували вестерн-блоттингом зі стрептавідином-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Синтетичний пептид, що містить гістидин, із С-кінцевим амідуванням (LHDALDAK-CONH2) використовувався для аналізу мічення in vitro на основі ближнього пептиду.У цьому аналізі 100 мкМ очищеного miniSOG, 10 мМ зонда 3 і 2 мкг/мл синтетичного пептиду змішували в PBS у загальному реакційному об’ємі 50 мкл.Реакційну суміш опромінювали синім світлодіодним світлом протягом 1 години при кімнатній температурі.Один мікролітр зразка аналізували за допомогою системи LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight мас-спектрометр із програмним забезпеченням спектрального аналізу MassLynx).
Клітини HEK293T, що стабільно експресують злитий ген miniSOG, висівали в 10 см чашки для ліній з різною локалізацією органел (Mito, ER, Nucleus) і 15 см чашки для ліній Parkin-miniSOG і BRD4-miniSOG.Після досягнення ~90% конфлюентності клітини один раз промивали HBSS, потім інкубували із зондом 3 у HBSS протягом 1 години при 37°C і освітлювали синім світлодіодом 10 Вт при кімнатній температурі.Для безконтактного мічення Parkin додавали 10 мкМ протонний карбонілціанід-носій м-хлорфенілгідразон CCCP (Solarbio, #C6700) із зондом 3 у HBSS на 1 годину при 37°C.Стадії лізису клітин, хімії клацання, відновлення та алкілування були такими ж, як описано вище, за винятком того, що додавали 2 мг лізату та в реакції клацання використовували азид біотину PEG3 замість азиду біотину, здатного до фотодеградації.Після збагачення кульки промивали 3 рази 5 мл PBS, що містить 0,2% SDS, 3 рази 5 мл PBS, що містить 1 М сечовину, і 3 рази 5 мл PBS.Після цього до 300 мкл 25 мМ ABC, що містить 1 М сечовини, додавали 2 мкг трипсину для розщеплення білка протягом ночі при 37°C.Реакцію зупиняли додаванням мурашиної кислоти до досягнення рН 2-3.Після трипсинізації на кульках розчин пептиду знесолювали за допомогою колонки SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) і сушили у вакуумному концентраторі Speedvac.Пептиди повторно розчиняли в 0,1% мурашиної кислоти і 500 нг пептидів аналізували за допомогою мас-спектрометра Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, оснащеного джерелом нано-ESI, описаним вище.Пептиди розділяли на комерційних попередніх колонках RP-HPLC (75 мкм x 2 см) (Thermo, № 164946) та аналітичних колонках RP-HPLC (75 мкм x 25 см) (Thermo, № 164941), обидві заповнені 2 мкм.градієнт від 8% до 35% ACN за 60 хвилин, потім лінійно збільшений до 98% B за 6 хвилин при швидкості потоку 300 нл/хв.MS-спектри (350-1500 m/z) були зібрані з роздільною здатністю 60 000, AGC 4 × 105 і максимальним часом введення 50 мс.Відібрані іони були послідовно фрагментовані за допомогою HCD в циклах 3 с з нормалізованою енергією зіткнення 30%, квадрупольним вікном ізоляції 1,6 m/z і роздільною здатністю 15000. Тандемна мішень AGC мас-спектрометра 5 × 104 і максимальний час введення 22 мс.Динамічне виключення встановлюється на 45 секунд. Невіднесені іони або іони із зарядом 1+ і >7+ були відхилені для MS/MS. Невіднесені іони або іони із зарядом 1+ і >7+ були відхилені для MS/MS. Неназначені іони або іони із зарядом 1+ і >7+ були відхилені для МС/МС. Невіднесені іони або іони із зарядом 1+ і >7+ були відхилені для MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。. Неуказані іони або іони з зарядами 1+ і >7+ були відхилені для МС/МС. Невизначені іони або іони із зарядами 1+ і >7+ були відхилені для MS/MS.
Етапи підготовки зразка до збагачення кульок NeutrAvidin були такими ж, як і в аналізі LC-MS/MS, описаному вище.Приблизно 50 мкг лізату використовували як вихідні дані для контролю завантаження, а 2 мг лізату використовували для реакцій клацання.Після збагачення та промивання нейтравідином зв'язані білки елюювали шляхом додавання 50 мкл буфера Леммлі до кульок агарозної смоли та кип'ятіння при 95°C протягом 5 хвилин.Контрольне навантаження та зразки, збагачені кульками, аналізували за допомогою SDS-PAGE та переносили на мембрани PVDF (Millipore, #ISEQ00010) стандартними методами вестерн-блоттингу.Мембрани блокували 5% знежиреним молоком (Sangon, #A600669) у TBS, що містить 0,1% твін-20 (TBST), та інкубували послідовно з первинними та вторинними антитілами.Первинні антитіла розводили 1:1000 у 5% знежиреному молоці в TBST та інкубували протягом ночі при 4°C.Вторинні антитіла використовували у співвідношенні 1:5000 та інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі.Мембрани візуалізували за допомогою хемілюмінесценції за допомогою системи візуалізації Chemidoc MP.Усі невирізані скани плям і гелів на малюнку представлені як вихідні дані.
Основні антитіла, використані в цьому дослідженні, включали кроляче анти-SFPQ моноклональне антитіло (CST, № 71992), кроляче анти-FUS моноклональне антитіло (CST, № 67840), кроляче анти-NSUN2 поліклональне антитіло (Proteintech, № 20854-1- AP), поліклональне антитіло кролика проти mSin3A (Abcam, #ab3479), моноклональне антитіло миші проти мітки (TransGen, #HT201-02), моноклональне антитіло миші проти β-актину (TransGen, #HC201-01), антитіло кролика -CDK2 моноклональне антитіло (ABclonal, #A0094), кроляче моноклональне антитіло до CTBP1 (ABclonal, #A11600), кроляче поліклональне антитіло до DUT (ABclonal, #A2901), кроляче поліклональне антитіло до PSMC4 (ABclonal, #A2505), кроляче анти- Поліклональне антитіло DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Ці антитіла використовували в розведенні 1:1000 у 5% знежиреному молоці в TBST.Вторинні антитіла, використані в цьому дослідженні, включали анти-кролячий IgG (TransGen, #HS101-01), анти-мишачий IgG (TransGen, #HS201-01) у розведенні 1:5000.
Для подальшого дослідження того, чи взаємодіє BRD4 із SFPQ, стабільні клітини HEK293T і BRD4-miniSOG із надмірною експресією HEK293T поміщали в чашки діаметром 10 см.Клітини промивали холодним PBS і лізували в 1 мл буфера для лізису Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) з інгібітором протеази, що не містить EDTA, протягом 30 хвилин при 4°C.Після цього лізати збирали в центрифужні пробірки на 1,5 мл і центрифугували при 15871xg протягом 10 хвилин при 4°C.Супернатант збирали та інкубували з 5 мкг міченого анти-V5 мишачого моноклонального антитіла (CST, #80076) протягом ночі при 4°C.Двічі промийте приблизно 50 мкл білкових A/G магнітних кульок (MCE, #HY-K0202) PBS, що містить 0,5% Tween-20.Потім клітинні лізати інкубували з магнітними кульками протягом 4 годин при 4°C з обертанням знизу вгору.Потім кульки чотири рази промивали 1 мл буфера PBST і кип'ятили при 95 ° C протягом 5 хв.Зразки аналізували на гелі SDS-PAGE і переносили на мембрани PVDF за допомогою стандартних методів Вестерн-блот.Мембрани блокували в 5% знежиреному молоці в TBST та інкубували послідовно з первинними та вторинними антитілами.Первинне антитіло Кроляче анти-SFPQ моноклональне антитіло (CST, №71992) використовували у співвідношенні 1:1000 у 5% знежиреному молоці в TBST та інкубували протягом ночі при 4°C.Анти-кролячі IgG використовували у співвідношенні 1:5000 та інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі.Мембрани візуалізували за допомогою хемілюмінесценції за допомогою системи візуалізації Chemidoc MP.
Усі структури, використані для аналізу площі поверхні, доступної розчинникам (SASA), були отримані з банку даних про білки (PDB)52 або бази даних структури білків AlphaFold53.Абсолютний SASA розраховували для кожного залишку за допомогою програми FreeSASA.Тільки повні та однозначні дані SASA для міченого гістидину та його сусідів використовувалися для отримання середнього SASA для кожної структури.Відносну доступність розчинника (RSA) для кожного гістидину розраховували шляхом ділення абсолютного значення SASA на емпіричну максимально можливу площу поверхні залишку, доступну для розчинника.Потім усі гістидини класифікували як приховані, якщо середнє RSA було нижче 20%, в іншому випадку вони піддавалися впливу56.
Необроблені файли, отримані в режимі DDA, шукали за допомогою Proteome Discoverer (v2.5) або MSfragger (Fragpipe v15.0) у відповідній верифікованій SwissProt базі даних білків, яка містить загальні забруднення.Пептиди вимагали повного трипсину з двома відсутніми сайтами розщеплення, метилюванням карбамоїлу як фіксованою модифікацією та окисленням метіоніну як динамічною модифікацією.Допуски на вагу прекурсора та фрагмента були встановлені на 10 ppm та 0,02 Da (MS2 Orbitrap) відповідно. Забруднювачі були видалені, а білки відфільтровані для отримання коефіцієнта помилкового виявлення <1%. Забруднювачі були видалені, а білки відфільтровані для отримання коефіцієнта помилкового виявлення <1%. Попадання загрязнювальних речовин були видалені, а білки відфільтровані, щоб отримати коефіцієнт ложного виявлення <1%. Забруднювачі були видалені, а білки відфільтровані, щоб отримати рівень помилкового виявлення <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。. <1% 的错误发现率. Попадання загрязнювальних речовин були видалені, а білки відфільтровані для досягнення рівня ложних виявлених <1%. Забруднювачі були видалені, а білки відфільтровані, щоб отримати хибнопозитивний рівень <1%.Для кількісного аналізу без використання міток використовували нормалізований вміст білка з трьох біологічних повторів.Аналіз субклітинної локалізації білків проводили за допомогою аналізу генної онтології (GO) від DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 і баз даних, зібраних і опублікованих групою Alice Ting.Карту вулкана було отримано з Perseus (v1.6.15.0). Кратні зміни кількості білка перевіряли на статистичну значущість за допомогою двостороннього t-критерію, а попадання білка ідентифікували зі зміною кількості >2 (якщо не вказано інше) і значенням p <0,05. Кратні зміни кількості білка перевіряли на статистичну значущість за допомогою двостороннього t-критерію, а попадання білка ідентифікували зі зміною кількості >2 (якщо не вказано інше) і значенням p <0,05. Зміна кратності вмісту білка була перевірена на статистичну значущість з використанням двостороннього t-критерію, і совпадіння білків були ідентифіковані зі зміною вмісту> 2 (якщо не вказано інше) і значенням p <0,05. Кратні зміни вмісту білка перевіряли на статистичну значущість за допомогою двостороннього t-критерію, і збіги білків ідентифікували зі зміною вмісту >2 (якщо не зазначено інше) і значенням ap <0,05.使用 双边 t 检验 测试 丰度 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 蛋白质 命 中 的 的 变化 变化 变化 变化 （另 有 说明） 和 p 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化 变化 变化 变化 （有 说明） 和 p 值 <0,05。 Статистичну значущість кратних змін вмісту білка перевіряли з використанням двостороннього t-критерію, а сукупність білків визначала для змін вмісту >2 (якщо не вказано інше) і p-значний <0,05. Статистичну значущість кратних змін у вмісті білка перевіряли за допомогою двостороннього t-критерію, і збіги білків визначали для змін вмісту >2 (якщо не вказано інше) і p-значень <0,05.Аналіз взаємодії білків проводили за допомогою аналізу GO разом із базою даних String.
Було проведено три біологічні повтори з однаковими результатами.Статистичний аналіз проводився за допомогою GraphPad Prism (програмне забезпечення GraphPad), а графіки вулканів були створені за допомогою Perseus (v1.6.15.0).Для порівняння двох груп р-значення визначали за допомогою двобічного t-критерію Стьюдента.Лише одиночні білки, ідентифіковані принаймні двічі в експериментальній групі, були включені до вулканічних графіків, а відповідні відсутні значення в контрольній групі були замінені на Perseus із нормального розподілу, щоб можна було обчислити p-значення.Смуги похибок представляють середнє значення ± стандартне відхилення.У протеомних аналізах для статистичного аналізу було збережено велику кількість білків, які з’явилися принаймні у двох біологічних репліках.Статистичні методи не використовувалися для попереднього визначення розміру вибірки.Експерименти не випадкові.Під час експерименту та оцінки результатів дослідники не закривали очі на завдання.
Щоб отримати додаткові відомості про дизайн дослідження, перегляньте анотацію звіту про дослідження природи, посилання на яку наведено в цій статті.
Дані мас-спектрометрії, отримані в цьому дослідженні, були надіслані до ProteomeXchange Consortium через партнерський репозиторій iProX57 під ідентифікатором набору даних PXD034811 (набір даних PDPL-MS).Необроблені дані надаються у формі файлів необроблених даних.У цій статті наведені вихідні дані.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Знайомство з околицями: використання залежного від близькості біотинілювання для характеристики білкових комплексів і картографування органел. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Знайомство з околицями: використання залежного від близькості біотинілювання для характеристики білкових комплексів і картографування органел.Gingras, AS, Abe, KT і Raut, B. Знайомство з оточенням: використання залежного від близькості біотинілювання для характеристики білкових комплексів і картографування органел. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘制细胞器图。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Розуміння сусідства: використовуйте залежність сусідства від біологічного життя.Gingras, AS, Abe, KT і Raut, B. Розуміння близькості: характеристика білкових комплексів і картографування органел за допомогою біотинілювання, що залежить від близькості.поточний.Моя думка.хімічний.біологія 48, 44–54 (2019).
Geri, JB та ін.Картування мікрооточення шляхом передачі енергії Декстера імунним клітинам.Наука 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL та ін.Двопротеомні масштабні мережі виявляють клітинно-специфічне ремоделювання інтерактома людини.Клітини 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Час публікації: 15 вересня 2022 р
