Новини

Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Ефективні фотосенсибілізатори особливо важливі для широкого клінічного застосування фототерапії.Однак звичайні фотосенсибілізатори зазвичай страждають від поглинання на короткій довжині хвилі, недостатньої фотостабільності, низького квантового виходу активних форм кисню (АФК) і гасіння АФК, спричиненого агрегацією.Тут ми повідомляємо про супрамолекулярний фотосенсибілізатор (RuDA) в ближньому інфрачервоному діапазоні (NIR), опосередкований самозбіркою Ru(II)-аренових металоорганічних комплексів у водному розчині.RuDA може генерувати лише синглетний кисень (1O2) в агрегованому стані, і він демонструє очевидну поведінку генерації 1O2, спричинену агрегацією, завдяки значному посиленню кросинговерного процесу між синглетно-триплетною системою.Під дією лазерного світла 808 нм RuDA демонструє квантовий вихід 1O2 16,4% (індоціаніновий зелений, схвалений FDA: ΦΔ=0,2%) і високу фототермічну ефективність перетворення 24,2% (комерційні золоті нанострижні) з чудовою фотостабільністю.: 21,0%, нанооболонки золота: 13,0%).Крім того, RuDA-NP з хорошою біосумісністю можуть переважно накопичуватися в місцях пухлини, викликаючи значну регресію пухлини під час фотодинамічної терапії зі зменшенням об’єму пухлини на 95,2% in vivo.Ця фотодинамічна терапія, що посилює агрегацію, забезпечує стратегію розробки фотосенсибілізаторів зі сприятливими фотофізичними та фотохімічними властивостями.
Порівняно зі звичайною терапією фотодинамічна терапія (ФДТ) є привабливим методом лікування раку завдяки своїм значним перевагам, таким як точний просторово-часовий контроль, неінвазивність, незначна стійкість до ліків і мінімізація побічних ефектів 1,2,3.Під світловим опроміненням використовувані фотосенсибілізатори можуть бути активовані з утворенням високоактивних форм кисню (АФК), що призводить до апоптозу/некрозу або імунної відповіді4,5. Однак більшість звичайних фотосенсибілізаторів, таких як хлорини, порфірини та антрахінони, мають відносно короткохвильове поглинання (частота < 680 нм), що призводить до поганого проникнення світла через інтенсивне поглинання біологічних молекул (наприклад, гемоглобіну та меланіну) у видима область6,7. Однак більшість звичайних фотосенсибілізаторів, таких як хлорини, порфірини та антрахінони, мають відносно короткохвильове поглинання (частота < 680 нм), що призводить до поганого проникнення світла через інтенсивне поглинання біологічних молекул (наприклад, гемоглобіну та меланіну) у видима область6,7. Однак більшість звичайних фотосенсибілізаторів, таких як хлорини, порфірини та антрахінони, мають відносно коротковолновим поглинанням (частота < 680 нм), що призводить до поганого проникнення світла через інтенсивне поглинання біологічних молекул (наприклад, гемоглобіну та меланіну) у видимій області6,7. Однак більшість поширених фотосенсибілізаторів, таких як хлорини, порфірини та антрахінони, мають відносно коротку довжину хвилі поглинання (< 680 нм), що призводить до поганого проникнення світла через інтенсивне поглинання біологічних молекул (наприклад, гемоглобіну та меланіну) у видимій області6,7.然而 ， 大多数 传统 光敏剂 ， ， 如 二 氢 卟酚 卟啉 卟啉 蒽醌 ， ， 具有 较 短 的 波长 吸收 （频率 <680 нм） ， 因此 对 生物 分子 （血红 血红 和 黑色素）） 强烈 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 ， ， ，导致光穿透性差。然而 ， 大多数 传统 光敏剂 ， ， 二 氢 卟酚 、 蒽醌 蒽醌 ， 具有 相对 较 的 的 吸收 （频率 频率 <680 нм） 因此 由于 对 分子 血红 蛋白 黑色素）） 的 ， ， ， ， 吸收 蛋白 黑色素） ， ， ， ， 吸收 吸收 黑色素 的 ， ， ， 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однак більшість традиційних фотосенсибілізаторів, таких як хлорини, порфірини та антрахінони, мають відносно коротковолновое поглинання (частота < 680 нм) із-за сильного поглинання біомолекул, таких як гемоглобін і меланін, що призводить до поганого проникнення світла. Однак більшість традиційних фотосенсибілізаторів, таких як хлорини, порфірини та антрахінони, мають відносно коротку довжину хвилі (частота < 680 нм) через сильне поглинання біомолекул, таких як гемоглобін і меланін, що призводить до поганого проникнення світла.Видима область 6.7.Таким чином, фотосенсибілізатори, що поглинають ближнє інфрачервоне випромінювання (NIR), які активуються в «терапевтичному вікні» 700–900 нм, добре підходять для фототерапії.Оскільки ближнє інфрачервоне світло найменше поглинається біологічними тканинами, це може призвести до глибшого проникнення та меншого фотопошкодження8,9.
На жаль, існуючі фотосенсибілізатори, що поглинають NIR, зазвичай мають низьку фотостабільність, низьку здатність генерувати синглетний кисень (1O2) і гасіння 1O2, викликане агрегацією, що обмежує їх клінічне застосування10,11.Незважаючи на те, що були докладені великі зусилля для покращення фотофізичних і фотохімічних властивостей звичайних фотосенсибілізаторів, наразі в кількох звітах повідомлялося, що фотосенсибілізатори, що поглинають NIR, можуть вирішити всі ці проблеми.Крім того, кілька фотосенсибілізаторів показали перспективи ефективного генерування 1O212,13,14 при опроміненні світлом понад 800 нм, оскільки енергія фотонів швидко зменшується в ближньому ІЧ-діапазоні.Трифеніламін (TFA) як донор електронів і [1,2,5]тіадіазол-[3,4-i]дипіридо[a,c]феназин (TDP) як група акцепторів електронів Барвники типу донор-акцептор (DA) клас барвників, що поглинають ближнє інфрачервоне випромінювання, які були широко вивчені для біозображення ближнього інфрачервоного діапазону II та фототермічної терапії (PTT) через їх вузьку заборонену зону.Таким чином, барвники типу DA можна використовувати для ФДТ із збудженням у ближньому ІЧ-діапазоні, хоча вони рідко вивчалися як фотосенсибілізатори для ФДТ.
Відомо, що висока ефективність міжсистемного кросингу (МСК) фотосенсибілізаторів сприяє утворенню 1O2.Загальною стратегією для просування процесу ISC є посилення спін-орбітального зв’язку (SOC) фотосенсибілізаторів шляхом введення важких атомів або спеціальних органічних фрагментів.Однак цей підхід все ще має деякі недоліки та обмеження19,20.Нещодавно супрамолекулярна самозбірка забезпечила інтелектуальний підхід «знизу вгору» для виготовлення функціональних матеріалів на молекулярному рівні, 21, 22 з численними перевагами у фототерапії: (1) самозбірні фотосенсибілізатори можуть мати потенціал для формування стрічкових структур.Подібно до електронних структур із більш щільним розподілом енергетичних рівнів через перекриття орбіт між будівельними блоками.Таким чином, енергетична відповідність між нижнім синглетним збудженим станом (S1) і сусіднім триплетним збудженим станом (Tn) буде покращена, що є корисним для процесу ISC 23, 24 .(2) Супрамолекулярна збірка зменшить безрадіаційну релаксацію на основі механізму обмеження внутрішньомолекулярного руху (RIM), який також сприяє процесу ISC 25, 26 .(3) Супрамолекулярна збірка може захистити внутрішні молекули мономеру від окислення та деградації, тим самим значно покращуючи фотостабільність фотосенсибілізатора.Враховуючи вищезазначені переваги, ми вважаємо, що супрамолекулярні фотосенсибілізуючі системи можуть бути багатообіцяючою альтернативою для подолання недоліків ФДТ.
Комплекси на основі Ru(II) є перспективною медичною платформою для потенційного застосування в діагностиці та терапії захворювань завдяки своїм унікальним і привабливим біологічним властивостям28,29,30,31,32,33,34.Крім того, велика кількість збуджених станів і регульовані фотофізико-хімічні властивості комплексів на основі Ru(II) забезпечують великі переваги для розробки фотосенсибілізаторів на основі Ru(II)35,36,37,38,39,40.Яскравим прикладом є поліпіридиловий комплекс рутенію(II) TLD-1433, який наразі проходить Фазу II клінічних випробувань як фотосенсибілізатор для лікування неінвазивного раку сечового міхура (NMIBC)41.Крім того, металоорганічні комплекси рутенію(II)арену широко використовуються як хіміотерапевтичні засоби для лікування раку через їх низьку токсичність і легкість модифікації42,43,44,45.Іонні властивості Ru(II)-аренових металоорганічних комплексів можуть не тільки покращити погану розчинність ДА-хромофорів у звичайних розчинниках, але й покращити збірку ДА-хромофорів.Крім того, псевдооктаедрична напівсендвічова структура металоорганічних комплексів Ru(II)-аренів може стерично запобігати Н-агрегації хромофорів типу DA, тим самим сприяючи утворенню J-агрегації зі зміщеними в червоний колір смугами поглинання.Однак властиві недоліки Ru(II)-аренових комплексів, такі як низька стабільність і/або низька біодоступність, можуть впливати на терапевтичну ефективність і in vivo активність арен-Ru(II) комплексів.Проте дослідження показали, що ці недоліки можна подолати інкапсуляцією комплексів рутенію з біосумісними полімерами шляхом фізичної інкапсуляції або ковалентної кон’югації.
У цій роботі ми повідомляємо про DA-кон’юговані комплекси Ru(II)-арену (RuDA) з тригером NIR через координаційний зв’язок між хромофором DAD і фрагментом Ru(II)-арену.Отримані комплекси можуть самозбиратися в металосупрамолекулярні везикули у воді завдяки нековалентним взаємодіям.Примітно, що супрамолекулярна збірка наділила RuDA властивостями міжсистемного кросинговеру, спричиненими полімеризацією, що значно підвищило ефективність ISC, що було дуже сприятливим для ФДТ (рис. 1А).Для збільшення накопичення пухлини та біосумісності in vivo схвалений FDA Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) використовувався для інкапсуляції RuDA47,48,49 для створення наночастинок RuDA-NP (рис. 1B), які діяли як високоефективний PDT/Dual- режим PTT proxy .У фототерапії раку (рис. 1C) RuDA-NP використовувався для лікування голих мишей з пухлинами MDA-MB-231 для вивчення ефективності PDT і PTT in vivo.
Схематична ілюстрація фотофізичного механізму RuDA в мономерній та агрегованій формах для фототерапії раку, синтез B RuDA-NP та C RuDA-NP для NIR-активованих PDT та PTT.
RuDA, що складається з функціональних груп TPA і TDP, готували згідно з процедурою, наведеною на Додатковому малюнку 1 (Малюнок 2A), і RuDA характеризували спектрами ЯМР 1H і 13C, іонізаційною мас-спектрометрією з електророзпиленням і елементним аналізом (Додаткові малюнки 2-4). ).Карта різниці електронної густини RuDA для найнижчого синглетного переходу була обчислена за допомогою теорії функціоналу густини, що залежить від часу (TD-DFT), для вивчення процесу перенесення заряду.Як показано на Додатковому малюнку 5, електронна щільність дрейфує головним чином від трифеніламіну до акцепторного блоку TDP після фотозбудження, що можна віднести до типового переходу внутрішньомолекулярного переносу заряду (CT).
Хімічна структура руди. B Спектри поглинання руди в сумішах різного співвідношення ДМФА та води.C Нормовані значення поглинання RuDA (800 нм) і ICG (779 нм) від часу при 0,5 Вт см-2 лазерного світла 808 нм.D Про фотодеградацію ABDA свідчить індуковане RuDA утворення 1O2 у сумішах DMF/H2O з різним вмістом води під дією лазерного випромінювання з довжиною хвилі 808 нм і потужністю 0,5 Вт/см2.
Анотація. Методом УФ-видимої абсорбційної спектроскопії досліджено властивості самоорганізації руди в сумішах ДМФА та води в різних співвідношеннях.Як показано на рис.2B, RuDA демонструє смуги поглинання від 600 до 900 нм у DMF з максимальною смугою поглинання при 729 нм.Збільшення кількості води призвело до поступового червоного зсуву максимуму поглинання Ore до 800 нм, що свідчить про J-агрегацію Ore в зібраній системі.Спектри фотолюмінесценції RuDA в різних розчинниках показані на додатковому малюнку 6. RuDA, здається, демонструє типову люмінесценцію NIR-II з максимальною довжиною хвилі випромінювання приблизно.1050 нм у CH2Cl2 та CH3OH відповідно.Великий стоксів зсув (близько 300 нм) RuDA свідчить про значну зміну геометрії збудженого стану та утворення низькоенергетичних збуджених станів.Визначено квантові виходи люмінесценції руди в CH2Cl2 і CH3OH, що становлять 3,3 і 0,6% відповідно.Однак у суміші метанолу та води (5/95, об./об.) спостерігалося незначне червоне зміщення випромінювання та зниження квантового виходу (0,22%), що може бути пов’язано з самозбіркою руди. .
Щоб візуалізувати самоскладання ORE, ми використовували рідинну атомно-силову мікроскопію (АСМ), щоб візуалізувати морфологічні зміни ORE в розчині метанолу після додавання води.Коли вміст води був нижче 80%, чіткої агрегації не спостерігалося (додатковий рис. 7).Проте при подальшому збільшенні вмісту води до 90–95 % з’являлися дрібні наночастинки, що свідчило про самоорганізацію Ore. Крім того, лазерне опромінення з довжиною хвилі 808 нм не впливало на інтенсивність поглинання RuDA у водному розчині. рішення (рис. 2C і додаткова рис. 8).Навпаки, абсорбція індоціанінового зеленого (ICG як контроль) швидко впала при 779 нм, що вказує на чудову фотостабільність RuDA.Крім того, стабільність RuDA-NP в PBS (pH = 5,4, 7,4 і 9,0), 10% FBS і DMEM (високий вміст глюкози) досліджували за допомогою УФ-видимої абсорбційної спектроскопії в різні моменти часу.Як показано на Додатковому малюнку 9, незначні зміни в смугах поглинання RuDA-NP спостерігалися в PBS при pH 7,4/9,0, FBS і DMEM, що вказує на чудову стабільність RuDA-NP.Проте в кислому середовищі (рН = 5,4) виявлено гідроліз руди.Ми також додатково оцінили стабільність RuDA та RuDA-NP за допомогою методів високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ).Як показано на Додатковому малюнку 10, RuDA був стабільним у суміші метанолу та води (50/50, об’єм/об’єм) протягом першої години, а гідроліз спостерігався через 4 години.Однак для НЧ RuDA спостерігався лише широкий увігнуто-опуклий пік.Тому для оцінки стабільності НЧ RuDA у PBS (pH = 7,4) використовували гельпроникну хроматографію (GPC).Як показано на Додатковому малюнку 11, після 8 годин інкубації в досліджуваних умовах висота піку, ширина піку та площа піку NP RuDA суттєво не змінилися, що вказує на чудову стабільність NP RuDA.Крім того, ТЕМ-зображення показали, що морфологія наночастинок RuDA-NP залишалася практично незмінною після 24 годин у розбавленому PBS-буфері (pH = 7,4, Додатковий рис. 12).
Оскільки самозбірка може надати руді різні функціональні та хімічні характеристики, ми спостерігали вивільнення 9,10-антрацендіілбіс(метилен)дималонової кислоти (ABDA, індикатор 1O2) у сумішах метанол-вода.Руда з різним вмістом води50.Як показано на малюнку 2D і додатковому малюнку 13, не спостерігалося деградації ABDA, коли вміст води був нижче 20%.При підвищенні вологості до 40 % відбувалася деградація АБДА, про що свідчить зменшення інтенсивності флуоресценції АБДА.Було також помічено, що вищий вміст води призводить до швидшої деградації, що свідчить про те, що самоскладання RuDA є необхідним і корисним для деградації ABDA.Це явище дуже відрізняється від сучасних хромофорів ACQ (гасіння, викликане агрегацією).При опроміненні лазером з довжиною хвилі 808 нм квантовий вихід 1O2 RuDA в суміші 98% H2O/2% DMF становить 16,4%, що в 82 рази вище, ніж у ICG (ΦΔ = 0,2%)51, демонструючи чудову ефективність генерації 1O2 RuDA в агрегатному стані.
Електронні спіни з використанням 2,2,6,6-тетраметил-4-піперидинону (TEMP) і 5,5-диметил-1-піролін-N-оксиду (DMPO) як спінових пасток Резонансна спектроскопія (ESR) використовувалася для ідентифікації отриманих видів AFK.від RuDA.Як показано на Додатковому малюнку 14, було підтверджено, що 1O2 утворюється за час опромінення від 0 до 4 хвилин.Крім того, коли RuDA інкубували з DMPO під опроміненням, було виявлено типовий чотирирядковий сигнал EPR 1:2:2:1 аддукту DMPO-OH·, що вказує на утворення гідроксильних радикалів (OH·).Загалом наведені вище результати демонструють здатність RuDA стимулювати вироблення АФК за допомогою процесу фотосенсибілізації подвійного типу I/II.
Щоб краще зрозуміти електронні властивості RuDA в мономерній та агрегованій формах, граничні молекулярні орбіталі RuDA в мономерній та димерній формах були розраховані за допомогою методу DFT.Як показано на рис.3A, найвища зайнята молекулярна орбіталь (HOMO) мономерного RuDA делокалізована вздовж скелета ліганду, а найнижча незаймана молекулярна орбіталь (LUMO) зосереджена на акцепторному блоці TDP.Навпаки, електронна густина в димерній HOMO зосереджена на ліганді однієї молекули RuDA, тоді як електронна густина в LUMO в основному зосереджена на акцепторній одиниці іншої молекули RuDA, що вказує на те, що RuDA знаходиться в димері.Особливості КТ.
A HOMO та LUMO руди обчислюються в мономерній та димерній формах.Б Синглетні та триплетні енергетичні рівні Оре в мономерах і димерах.C Розрахункові рівні RuDA та можливі канали ISC як мономерні C та димерні D. Стрілки вказують на можливі канали ISC.
За допомогою програмного забезпечення Multiwfn 3.852.53 аналізували розподіл електронів і дірок у низькоенергетичних синглетних збуджених станах RuDA в мономерній і димерній формах, які розраховували методом TD-DFT.Як зазначено на додатковій етикетці.Як показано на малюнках 1-2, мономерні дірки RDA здебільшого делокалізовані вздовж скелета ліганду в цих синглетно збуджених станах, тоді як електрони здебільшого розташовані в групі TDP, що демонструє внутрішньомолекулярні характеристики CT.Крім того, для цих синглетно-збуджених станів існує більш-менш перекривання між дірками та електронами, що свідчить про те, що ці синглетно-збуджені стани роблять певний внесок від локального збудження (LE).Для димерів, на додаток до внутрішньомолекулярних CT та LE ознак, певна частка міжмолекулярних CT ознак спостерігалася у відповідних станах, особливо S3, S4, S7 та S8, на основі аналізу міжмолекулярної CT, з CT міжмолекулярними переходами як основними. (Додаткова таблиця).3).
Щоб краще зрозуміти експериментальні результати, ми додатково дослідили властивості збуджених станів RuDA, щоб дослідити відмінності між мономерами та димерами (додаткові таблиці 4–5).Як показано на малюнку 3B, енергетичні рівні синглетного та триплетного збуджених станів димера набагато щільніші, ніж у мономера, що допомагає зменшити енергетичний розрив між S1 і Tn. Повідомлялося, що переходи ISC можуть бути реалізовані в межах невеликого енергетичного проміжку (ΔES1-Tn < 0,3 еВ) між S1 і Tn54. Повідомлялося, що переходи ISC можуть бути реалізовані в межах невеликого енергетичного проміжку (ΔES1-Tn < 0,3 еВ) між S1 і Tn54. Повідомлялося, що переходи ISC можуть бути реалізовані в межах невеликої енергетичної щілини (ΔES1-Tn <0,3 еВ) між S1 і Tn54. Повідомлялося, що переходи ISC можуть бути реалізовані в межах невеликого енергетичного проміжку (ΔES1-Tn <0,3 еВ) між S1 і Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙９(ΔES1-Tn < 0,3 еВ)内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙９(ΔES1-Tn < 0,3 еВ)内实现。 Повідомлялося, що перехід ISC може бути реалізований в межах невеликої енергетичної щілини (ΔES1-Tn < 0,3 еВ) між S1 і Tn54. Повідомлялося, що перехід ISC може бути реалізований в межах невеликого енергетичного проміжку (ΔES1-Tn < 0,3 еВ) між S1 і Tn54.Крім того, лише одна орбіталь, зайнята чи вільна, має відрізнятися у зв’язаних синглетних і триплетних станах, щоб забезпечити ненульовий інтеграл SOC.Таким чином, на основі аналізу енергії збудження та орбітального переходу всі можливі канали переходу ISC показані на рис.3C,D.Примітно, що в мономері доступний лише один канал ISC, тоді як димерна форма має чотири канали ISC, які можуть посилити перехід ISC.Тому розумно припустити, що чим більше молекул RuDA агреговано, тим доступнішими будуть канали ISC.Таким чином, агрегати RuDA можуть утворювати двозонні електронні структури в синглетному та триплетному станах, зменшуючи енергетичний розрив між S1 та доступним Tn, тим самим збільшуючи ефективність ISC для полегшення генерації 1O2.
Для подальшого з’ясування механізму, що лежить в основі, ми синтезували еталонну сполуку комплексу арен-Ru(II) (RuET) шляхом заміни двох етилових груп двома трифеніламінфенільними групами в RuDA (рис. 4A, для повної характеристики див. ESI, Додатковий 15). -21 ) Від донора (діетиламіну) до акцептора (TDF) RuET має ті самі внутрішньомолекулярні характеристики CT, що й RuDA.Як і очікувалося, спектр поглинання RuET в DMF показав низьку смугу перенесення заряду з сильним поглинанням у ближній інфрачервоній області в області 600–1100 нм (рис. 4B).Крім того, агрегація RuET також спостерігалася зі збільшенням вмісту води, що відображалося в червоному зміщенні максимуму поглинання, що було додатково підтверджено рідким АСМ-зображенням (додатковий рис. 22).Результати показують, що RuET, як і RuDA, може формувати внутрішньомолекулярні стани та самозбиратися в агреговані структури.
Хімічна структура РуЕТ.B Спектри поглинання RuET в сумішах різного співвідношення ДМФА та води.Ділянки C EIS Nyquist для RuDA і RuET.Відповіді фотоструму Д РуДА і РуЕТ під дією лазерного випромінювання з довжиною хвилі 808 нм.
Фотодеградацію АБДА в присутності РуЕТ оцінювали за допомогою опромінення лазером з довжиною хвилі 808 нм.Дивно, але жодної деградації ABDA не спостерігалося в різних фракціях води (додатковий рис. 23).Можлива причина полягає в тому, що RuET не може ефективно формувати смугову електронну структуру, оскільки етиловий ланцюг не сприяє ефективному міжмолекулярному перенесенню заряду.Тому для порівняння фотоелектрохімічних властивостей RuDA та RuET було проведено електрохімічну імпедансну спектроскопію (EIS) та вимірювання перехідного фотоструму.Згідно з графіком Найквіста (рис. 4C), RuDA показує набагато менший радіус, ніж RuET, що означає, що RuDA56 має швидший міжмолекулярний транспорт електронів і кращу провідність.Крім того, щільність фотоструму RuDA набагато вища, ніж у RuET (рис. 4D), що підтверджує кращу ефективність перенесення заряду RuDA57.Таким чином, фенільна група трифеніламіну в руді відіграє важливу роль у забезпеченні міжмолекулярного переносу заряду та утворенні смугової електронної структури.
Щоб збільшити накопичення пухлини та біосумісність in vivo, ми додатково інкапсулювали RuDA з F127.Середній гідродинамічний діаметр RuDA-NPs був визначений як 123,1 нм з вузьким розподілом (PDI = 0,089) за допомогою методу динамічного розсіювання світла (DLS) (рис. 5A), який сприяв накопиченню пухлини шляхом збільшення проникності та утримання.ЕПР).ПЕМ-зображення показали, що НЧ Ore мають однорідну сферичну форму із середнім діаметром 86 нм.Примітно, що максимум поглинання RuDA-NP з’явився при 800 нм (додатковий рис. 24), що вказує на те, що RuDA-NP можуть зберігати функції та властивості RuDA, що самозбираються.Розрахований квантовий вихід АФК для NP Ore становить 15,9%, що порівнянно з Ore. Фототермічні властивості НЧ RuDA досліджували під дією лазерного випромінювання з довжиною хвилі 808 нм за допомогою інфрачервоної камери.Як показано на рис.5B, C, у контрольній групі (тільки PBS) спостерігалося невелике підвищення температури, тоді як температура розчину RuDA-NPs швидко зростала зі збільшенням температури (ΔT) до 15,5, 26,1 і 43,0 °C.Високі концентрації становили 25, 50 і 100 мкМ відповідно, що свідчить про сильний фототермічний ефект НЧ RuDA.Крім того, були проведені вимірювання циклу нагрівання/охолодження для оцінки фототермічної стабільності RuDA-NP і порівняння з ICG.Температура наночастинок Ore не знизилася після п’яти циклів нагрівання/охолодження (рис. 5D), що вказує на відмінну фототермічну стабільність наночастинок Ore.Навпаки, ICG демонструє нижчу фототермічну стабільність, як видно з очевидного зникнення плато фототермічної температури за тих же умов.Відповідно до попереднього методу58, ефективність фототермічного перетворення (PCE) RuDA-NP була розрахована як 24,2%, що вище, ніж у існуючих фототермічних матеріалів, таких як золоті нанострижні (21,0%) і золоті нанооболонки (13,0%)59.Таким чином, NP Ore демонструють відмінні фототермічні властивості, що робить їх перспективними агентами PTT.
Аналіз DLS та TEM зображень НЧ RuDA (вставка).B Теплові зображення різних концентрацій НЧ RuDA під впливом лазерного випромінювання з довжиною хвилі 808 нм (0,5 Вт см-2).C Криві фототермічного перетворення різних концентрацій рудних НЧ, які є кількісними даними.B. D Підвищення температури ORE NP та ICG протягом 5 циклів нагрівання-охолодження.
Фотоцитотоксичність RuDA NP проти клітин раку молочної залози людини MDA-MB-231 оцінювали in vitro.Як показано на рис.6A, B, RuDA-NP та RuDA демонстрували незначну цитотоксичність за відсутності опромінення, що свідчить про нижчу темнову токсичність RuDA-NP та RuDA.Однак після впливу лазерного випромінювання з довжиною хвилі 808 нм RuDA та RuDA NPs показали сильну фотоцитотоксичність проти ракових клітин MDA-MB-231 зі значеннями IC50 (половина максимальної інгібуючої концентрації) 5,4 та 9,4 мкМ відповідно, демонструючи, що що RuDA-NP і RuDA мають потенціал для фототерапії раку.Крім того, фотоцитотоксичність RuDA-NP і RuDA була додатково досліджена в присутності вітаміну С (Vc), поглинача АФК, щоб з’ясувати роль АФК у цитотоксичності, спричиненій світлом.Очевидно, життєздатність клітин зросла після додавання Vc, і значення IC50 для НЧ RuDA і RuDA становили 25,7 і 40,0 мкМ відповідно, що доводить важливу роль АФК у фотоцитотоксичності НЧ RuDA і RuDA.Світлоіндукована цитотоксичність RuDA-NP і RuDA в ракових клітинах MDA-MB-231 за допомогою фарбування живих/мертвих клітин із застосуванням кальцеїну AM (зелена флуоресценція для живих клітин) і пропідію йодиду (PI, червона флуоресценція для мертвих клітин).підтверджено клітинами) як флуоресцентні зонди.Як показано на малюнку 6C, клітини, оброблені RuDA-NP або RuDA, залишалися життєздатними без опромінення, про що свідчить інтенсивна зелена флуоресценція.Навпаки, під лазерним опроміненням спостерігалася лише червона флуоресценція, що підтверджує ефективну фотоцитотоксичність RuDA або RuDA NPs.Слід зазначити, що при додаванні Vc з’являлася зелена флуоресценція, що свідчить про порушення фотоцитотоксичності RuDA та НЧ RuDA.Ці результати узгоджуються з аналізами фотоцитотоксичності in vitro.
Дозозалежна життєздатність клітин A RuDA- та B RuDA-NP у клітинах MDA-MB-231 у присутності або відсутності Vc (0,5 мМ) відповідно.Смуги похибок, середнє ± стандартне відхилення (n = 3). Непарні двосторонні t-тести *p < 0,05, **p < 0,01 і ***p < 0,001. Непарні двосторонні t-тести *p < 0,05, **p < 0,01 і ***p < 0,001. Непарні двосторонні t-критерії *p <0,05, **p <0,01 і ***p <0,001. Непарні двобічні t-тести *p<0,05, **p<0,01 і ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарні двосторонні t-тести *p <0,05, **p <0,01 і ***p <0,001. Непарні двобічні t-тести *p<0,05, **p<0,01 і ***p<0,001.C Аналіз фарбування живих/мертвих клітин із використанням кальцеїну AM та йодиду пропідію як флуоресцентних зондів.Масштабна шкала: 30 мкм.Показано репрезентативні зображення трьох біологічних повторів з кожної групи.D Конфокальні флуоресцентні зображення виробництва АФК у клітинах MDA-MB-231 за різних умов лікування.Зелена флуоресценція DCF вказує на наявність АФК.Опромінюють лазером з довжиною хвилі 808 нм з потужністю 0,5 Вт/см2 протягом 10 хвилин (300 Дж/см2).Масштабна шкала: 30 мкм.Показано репрезентативні зображення трьох біологічних повторів з кожної групи.E Проточна цитометрія Аналіз лікування RuDA-NPs (50 мкМ) або RuDA (50 мкМ) з лазером 808 нм (0,5 Вт см-2) або без нього за присутності та відсутності Vc (0,5 мМ) протягом 10 хв.Показано репрезентативні зображення трьох біологічних повторів з кожної групи.F Nrf-2, HSP70 і HO-1 клітин MDA-MB-231, оброблених RuDA-NP (50 мкМ) з або без лазерного опромінення 808 нм (0,5 Вт см-2, 10 хв, 300 Дж см-2), клітини експресують 2).Показано репрезентативні зображення двох біологічних повторів з кожної групи.
Внутрішньоклітинну продукцію АФК у клітинах MDA-MB-231 досліджували за допомогою методу фарбування 2,7-дихлордигідрофлуоресцеїну діацетатом (DCFH-DA).Як показано на рис.6D, клітини, оброблені RuDA-NPs або RuDA, демонстрували виразну зелену флуоресценцію при опроміненні лазером 808 нм, що вказує на те, що RuDA-NPs і RuDA мають ефективну здатність генерувати ROS.Навпаки, за відсутності світла або за наявності Vc спостерігався лише слабкий флуоресцентний сигнал клітин, що вказувало на незначне утворення АФК.Внутрішньоклітинні рівні АФК у клітинах RuDA-NP і клітинах MDA-MB-231, оброблених RuDA, були додатково визначені за допомогою проточної цитометрії.Як показано на Додатковому малюнку 25, середня інтенсивність флуоресценції (MFI), створена RuDA-NP та RuDA під лазерним опроміненням 808 нм, була значно збільшена приблизно в 5,1 та 4,8 рази, відповідно, порівняно з контрольною групою, підтверджуючи їх чудове формування AFK.місткість.Однак внутрішньоклітинні рівні АФК у клітинах RuDA-NP або MDA-MB-231, оброблених RuDA, можна порівняти лише з контролем без лазерного опромінення або в присутності Vc, подібно до результатів аналізу конфокальної флуоресценції.
Показано, що головною мішенню Ru(II)-аренових комплексів є мітохондрії60.Таким чином, була досліджена субклітинна локалізація RuDA та RuDA-NP.Як показано на Додатковому малюнку 26, RuDA та RuDA-NP демонструють подібні профілі клітинного розподілу з найбільшим накопиченням у мітохондріях (62,5 ± 4,3 та 60,4 ± 3,6 нг/мг білка відповідно).Проте в ядерних фракціях Ore і NP Ore виявлено лише невелику кількість Ru (3,5 і 2,1% відповідно).Решта клітинної фракції містила залишковий рутеній: 31,7% (30,6 ± 3,4 нг/мг білка) для RuDA і 42,9% (47,2 ± 4,5 нг/мг білка) для RuDA-NP.Загалом, Ore та NP Ore в основному накопичуються в мітохондріях.Для оцінки мітохондріальної дисфункції ми використовували фарбування JC-1 і MitoSOX Red для оцінки потенціалу мітохондріальної мембрани та здатності до виробництва супероксиду відповідно.Як показано на Додатковому малюнку 27, інтенсивна зелена (JC-1) і червона (MitoSOX Red) флуоресценція спостерігалася в клітинах, оброблених як RuDA, так і RuDA-NP під лазерним опроміненням 808 нм, що вказує на те, що і RuDA, і RuDA-NP мають високу флуоресценцію. Він може ефективно індукувати деполяризацію мітохондріальної мембрани та виробництво супероксиду.Крім того, механізм загибелі клітин визначали за допомогою аналізу аннексину V-FITC/пропідію йодиду (PI) на основі проточної цитометрії.Як показано на малюнку 6E, під час опромінення лазером 808 нм RuDA та RuDA-NP індукували значно підвищену швидкість раннього апоптозу (нижній правий квадрант) у клітинах MDA-MB-231 порівняно з лазером PBS або PBS plus.оброблені клітини.Однак при додаванні Vc швидкість апоптозу RuDA і RuDA-NP значно знизилася з 50,9% і 52,0% до 15,8% і 17,8% відповідно, що підтверджує важливу роль АФК у фотоцитотоксичності RuDA і RuDA-NP..Крім того, невеликі некротичні клітини спостерігалися в усіх протестованих групах (верхній лівий квадрант), що свідчить про те, що апоптоз може бути переважною формою загибелі клітин, індукованої RuDA та RuDA-NP.
Оскільки пошкодження, викликане окислювальним стресом, є основною детермінантою апоптозу, ядерний фактор, пов’язаний з еритроїдом 2, фактором 2 (Nrf2) 62, ключовим регулятором антиоксидантної системи, було досліджено в MDA-MB-231, обробленому RuDA-NPs.Механізм дії НЧ РуДА, індукованих опроміненням.У той же час була також виявлена ​​експресія нижнього білка гемоксигенази 1 (HO-1).Як показано на малюнку 6F і додатковому малюнку 29, опосередкована RuDA-NP фототерапія збільшила рівні експресії Nrf2 і HO-1 порівняно з групою PBS, що вказує на те, що RuDA-NP можуть стимулювати сигнальні шляхи окисного стресу.Крім того, для вивчення фототермічного ефекту RuDA-NPs63 також оцінювали експресію білка теплового шоку Hsp70.Зрозуміло, що клітини, оброблені RuDA-NPs + 808 нм лазерне опромінення, продемонстрували підвищену експресію Hsp70 порівняно з двома іншими групами, що відображає клітинну відповідь на гіпертермію.
Чудові результати in vitro спонукали нас дослідити ефективність RuDA-NP in vivo у голих мишей з пухлинами MDA-MB-231.Тканинний розподіл НЧ RuDA вивчали шляхом визначення вмісту рутенію в печінці, серці, селезінці, нирках, легенях, пухлинах.Як показано на рис.7A, максимальний вміст НЧ Ore в нормальних органах з’явився в перший час спостереження (4 години), тоді як максимальний вміст був визначений у пухлинних тканинах через 8 годин після ін’єкції, можливо, через НЧ Ore.ЕПР ефект НЧ.За результатами розподілу оптимальна тривалість лікування НП рудою була 8 годин після прийому.Щоб проілюструвати процес накопичення RuDA-NPs у пухлинних ділянках, фотоакустичні (PA) властивості RuDA-NPs контролювали шляхом реєстрації сигналів PA RuDA-NPs у різний час після ін’єкції.Спочатку PA-сигнал RuDA-NP оцінювали in vivo шляхом запису PA-зображень ділянки пухлини після внутрішньопухлинної ін’єкції RuDA-NP.Як показано на Додатковому малюнку 30, RuDA-NP показали сильний сигнал PA, і була позитивна кореляція між концентрацією RuDA-NP та інтенсивністю сигналу PA (Додатковий малюнок 30A).Потім in vivo PA зображення ділянок пухлини записували після внутрішньовенної ін’єкції RuDA та RuDA-NP у різні моменти часу після ін’єкції.Як показано на малюнку 7B, PA-сигнал RuDA-NP від ​​ділянки пухлини поступово збільшувався з часом і досяг плато через 8 годин після ін’єкції, що відповідає результатам розподілу в тканинах, визначеним аналізом ICP-MS.Стосовно RuDA (додатковий рис. 30B), максимальна інтенсивність сигналу PA з’явилася через 4 години після ін’єкції, що вказує на швидку швидкість проникнення RuDA в пухлину.Крім того, екскреторну поведінку RuDA та RuDA-NPs досліджували шляхом визначення кількості рутенію в сечі та фекаліях за допомогою ICP-MS.Основний шлях виведення RuDA (додатковий рис. 31) і RuDA-NPs (рис. 7C) відбувається через фекалії, і ефективний виведення RuDA і RuDA-NPs спостерігався протягом 8-денного періоду дослідження, що означає, що RuDA і RuDA-NP можуть ефективно виводитися з організму без тривалої токсичності.
A. Ex vivo розподіл RuDA-NP у тканинах миші визначали за вмістом Ru (відсоток введеної дози Ru (ID) на грам тканини) у різний час після ін’єкції.Дані є середніми ± стандартне відхилення (n = 3). Непарні двосторонні t-тести *p < 0,05, **p < 0,01 і ***p < 0,001. Непарні двосторонні t-тести *p < 0,05, **p < 0,01 і ***p < 0,001. Непарні двосторонні t-критерії *p <0,05, **p <0,01 і ***p <0,001. Непарні двобічні t-тести *p<0,05, **p<0,01 і ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарні двосторонні t-тести *p <0,05, **p <0,01 і ***p <0,001. Непарні двобічні t-тести *p<0,05, **p<0,01 і ***p<0,001.B PA зображення ділянок пухлини in vivo при збудженні 808 нм після внутрішньовенного введення RuDA-NP (10 мкмоль кг-1) у різні моменти часу.Після внутрішньовенного введення RuDA NP (10 мкмоль кг-1) C Ru виділявся у мишей із сечею та фекаліями через різні проміжки часу.Дані є середніми ± стандартне відхилення (n = 3).
Нагрівальну здатність RuDA-NP in vivo вивчали на голих мишах з пухлинами MDA-MB-231 і RuDA для порівняння.Як показано на рис.8A та додатковий рис. 32, контрольна (фізіологічний розчин) група продемонструвала меншу зміну температури (ΔT ≈ 3 °C) після 10 хвилин безперервного впливу.Однак температура RuDA-NP і RuDA швидко зростала з максимальними температурами 55,2 і 49,9 °C відповідно, забезпечуючи достатню гіпертермію для терапії раку in vivo.Спостережуване підвищення високої температури для НЧ RuDA (ΔT ≈ 24°C) порівняно з RuDA (ΔT ≈ 19°C) може бути пов’язане з його кращою проникністю та накопиченням у тканинах пухлини через ефект ЕПР.
Інфрачервоні теплові зображення мишей з пухлинами MDA-MB-231, опромінених лазером 808 нм у різний час через 8 годин після ін’єкції.Показано репрезентативні зображення чотирьох біологічних повторів з кожної групи.B Відносний об’єм пухлини та C Середня маса пухлини різних груп мишей під час лікування.D Криві маси тіла різних груп мишей.Опромінюють лазером з довжиною хвилі 808 нм з потужністю 0,5 Вт/см2 протягом 10 хвилин (300 Дж/см2).Смуги похибок, середнє ± стандартне відхилення (n = 3). Непарні двосторонні t-тести *p < 0,05, **p < 0,01 і ***p < 0,001. Непарні двосторонні t-тести *p < 0,05, **p < 0,01 і ***p < 0,001. Непарні двосторонні t-критерії *p <0,05, **p <0,01 і ***p <0,001. Непарні двобічні t-тести *p<0,05, **p<0,01 і ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарні двосторонні t-тести *p <0,05, **p <0,01 і ***p <0,001. Непарні двобічні t-тести *p<0,05, **p<0,01 і ***p<0,001. E H&E зображення основних органів і пухлин з різних груп лікування, включаючи фізіологічний розчин, фізіологічний розчин + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs і RuDA-NPs + лазер. E H&E зображення основних органів і пухлин з різних груп лікування, включаючи фізіологічний розчин, фізіологічний розчин + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs і RuDA-NPs + лазер. Зразки оформлення E H&E основних і опухолей органів із різних груп лікування, включаючи групи фізіологічного розчину, фізіологічного розчину + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs і RuDA-NPs + Laser. E H&E зображення основних органів і пухлин із різних груп лікування, включаючи фізіологічний розчин, фізіологічний розчин + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs і RuDA-NPs + лазер.来自 不同 治疗 组 的 主要 器官 和 肿瘤 的 e h & e 染色 图像 ， 包括 盐水 盐 盐 水 + 激光 、 ruda 、 ruda + 激光 、 ruda-nps 和 ruda-nps + 激光组。来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основних органів і опухолей з різних груп лікування, включаючи фізіологічний розчин, фізіологічний розчин + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs і RuDA-NPs + лазер. Фарбування E H&E основних органів і пухлин з різних груп лікування, включаючи фізіологічний розчин, фізіологічний розчин + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs і RuDA-NPs + лазер.Масштабна шкала: 60 ​​мкм.
Ефект фототерапії in vivo з RuDA та RuDA NPs був оцінений, у якому голим мишам з пухлинами MDA-MB-231 внутрішньовенно вводили RuDA або RuDA NPs у одноразовій дозі 10,0 мкмоль кг-1 через хвостову вену, а потім 8 годин після ін'єкції.лазерне опромінення з довжиною хвилі 808 нм.Як показано на малюнку 8B, об’єми пухлини були значно збільшені в групах фізіологічного розчину та лазера, що вказує на те, що опромінення фізіологічним розчином або лазером 808 мало вплив на ріст пухлини.Як і в групі фізіологічного розчину, також спостерігався швидкий ріст пухлини у мишей, які отримували RuDA-NP або RuDA за відсутності лазерного опромінення, що демонструє їх низьку токсичність у темряві.Навпаки, після лазерного опромінення лікування як RuDA-NP, так і RuDA спричинило значну регресію пухлини зі зменшенням об’єму пухлини на 95,2% і 84,3% відповідно порівняно з групою лікування фізіологічним розчином, що вказує на відмінну синергетичну ФДТ., опосередкований ефектом RuDA/CHTV.– NP або Ore. Порівняно з RuDA, NPs RuDA показали кращий фототерапевтичний ефект, який був зумовлений головним чином EPR ефектом NPs RuDA.Результати пригнічення росту пухлини додатково оцінювали за масою пухлини, вирізаної на 15 день лікування (рис. 8C і додаткова рис. 33).Середня маса пухлини у мишей, які отримували RuDA-NP, і мишей, які отримували RuDA, становила 0,08 і 0,27 г відповідно, що було набагато менше, ніж у контрольній групі (1,43 г).
Крім того, кожні три дні реєстрували масу тіла мишей для вивчення темної токсичності RuDA-NP або RuDA in vivo.Як показано на Фігурі 8D, суттєвих відмінностей у масі тіла не спостерігалося для всіх груп лікування. Крім того, було проведено фарбування гематоксиліном та еозином (H&E) основних органів (серце, печінка, селезінка, легені та нирки) у різних групах лікування. Крім того, було проведено фарбування гематоксиліном та еозином (H&E) основних органів (серце, печінка, селезінка, легені та нирки) у різних групах лікування. Крім того, було проведено окрашування гематоксиліном і еозином (H&E) основних органів (серця, печені, селезенки, легких і почок) з різних груп лікування. Крім того, було проведено фарбування гематоксиліном та еозином (H&E) основних органів (серце, печінка, селезінка, легені та нирки) у різних групах лікування.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行苏木精和伊红(H&E) 染色。 (ВІН) Крім того, проводили ослаблення гематоксиліном і еозином (H&E) основних органів (серця, печені, селезенки, легких і почок) в різних групах лікування. Крім того, у різних групах лікування було проведено фарбування основних органів (серця, печінки, селезінки, легенів і нирок) гематоксиліном і еозином (H&E).Як показано на рис.8E, зображення фарбування H&E п’яти основних органів з груп RuDA-NP та RuDA не демонструють очевидних аномалій або пошкоджень органів. 8E, зображення фарбування H&E п’яти основних органів з груп RuDA-NP та RuDA не демонструють очевидних аномалій або пошкоджень органів.Як показано на рис.8E, зображення окрашивания H&E п'яти основних органів з групи RuDA-NPs і RuDA не демонструють явних аномалій або пошкоджень органів. 8E, зображення фарбування H&E п’яти основних органів із груп RuDA-NP та RuDA не показують явних аномалій або уражень органів.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出明显的异常或器官损如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Як показано на малюнку 8E, зображення окрашування H&E п'яти основних органів з групи RuDA-NPs і RuDA не показали явних аномалій або пошкоджень. Як показано на малюнку 8E, зображення фарбування H&E п’яти основних органів із груп RuDA-NP та RuDA не показали явних аномалій або пошкоджень органів.Ці результати показали, що ні RuDA-NP, ні RuDA не виявили ознак токсичності in vivo. Крім того, зображення пухлин, забарвлені H&E, показали, що обидві групи RuDA + Laser і RuDA-NPs + Laser можуть викликати серйозне руйнування ракових клітин, демонструючи чудову фототерапевтичну ефективність RuDA та RuDA-NPs in vivo. Крім того, зображення пухлин, забарвлені H&E, показали, що обидві групи RuDA + Laser і RuDA-NPs + Laser можуть викликати серйозне руйнування ракових клітин, демонструючи чудову фототерапевтичну ефективність RuDA та RuDA-NPs in vivo.Крім того, зображення пухлин, забарвлені гематоксиліном-еозином, показали, що обидві групи RuDA+Laser і RuDA-NPs+Laser можуть індукувати серйозне руйнування ракових клітин, демонструючи чудову фототерапевтичну ефективність RuDA та RuDA-NPs in vivo.此外 ， 肿瘤 的 h & e 染色 图像 显示 ， ， ruda + лазер 和 ruda-nps + лазер 组均 导致 严重 的 癌细胞 破坏 ， 证明 了 了。 和 和 ruda-np此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ruda + лазер 和 ruda-nps + лазер 组均 导致 的 癌 破坏 ， 证明 了 了 ruda 和 ruda-nps 的 体内 光疗 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 .. .. ..Крім того, зображення пухлин, пофарбовані гематоксиліном і еозином, показали, що обидві групи RuDA+Laser і RuDA-NPs+Laser призвели до серйозного руйнування ракових клітин, демонструючи чудову фототерапевтичну ефективність RuDA і RuDA-NPs in vivo.
На завершення металоорганічний комплекс Ru(II)-арен (RuDA) з лігандами типу DA був розроблений для полегшення процесу ISC за допомогою методу агрегації.Синтезований RuDA може самозбиратися за допомогою нековалентних взаємодій з утворенням супрамолекулярних систем, отриманих від RuDA, тим самим сприяючи утворенню 1O2 та ефективному фототермальному перетворенню для індукованої світлом терапії раку.Примітно, що мономерний RuDA не генерував 1O2 під лазерним опроміненням на 808 нм, але міг генерувати велику кількість 1O2 в агрегатному стані, демонструючи раціональність та ефективність нашої конструкції.Подальші дослідження показали, що супрамолекулярна збірка наділяє RuDA покращеними фотофізичними та фотохімічними властивостями, такими як поглинання червоного зсуву та стійкість до фотовідбілювання, які є дуже бажаними для обробки PDT та PTT.Експерименти in vitro та in vivo показали, що наночастинки RuDA з хорошою біосумісністю та хорошим накопиченням у пухлині виявляють чудову індуковану світлом протиракову активність під час лазерного опромінення з довжиною хвилі 808 нм.Таким чином, НЧ RuDA як ефективні бімодальні супрамолекулярні реагенти ФДТ/ПТВ збагатять набір фотосенсибілізаторів, активованих на довжинах хвиль понад 800 нм.Концептуальний дизайн супрамолекулярної системи забезпечує ефективний шлях для фотосенсибілізаторів, що активуються NIR, із чудовими ефектами фотосенсибілізації.
Усі хімікати та розчинники були отримані від комерційних постачальників і використані без додаткового очищення.RuCl3 був придбаний у Boren Precious Metals Co., Ltd. (Куньмін, Китай).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-фенантролін-5,6-діон) і 4,7-біс[4-(N,N-дифеніламіно)феніл]-5 ,6-Діаміно-2,1,3-бензотіадіазол був синтезований згідно з попередніми дослідженнями64,65.Спектри ЯМР записували на спектрометрі Bruker Avance III-HD 600 МГц в Аналітичному випробувальному центрі Південно-Східного університету з використанням d6-DMSO або CDCl3 як розчинника.Хімічні зсуви δ наведені в ppm.по відношенню до тетраметилсилану, а константи взаємодії J наведені в абсолютних значеннях в герцах.Мас-спектрометрію високої роздільної здатності (HRMS) проводили на приладі Agilent 6224 ESI/TOF MS.Елементний аналіз C, H і N проводили на елементному аналізаторі Vario MICROCHNOS (Elementar).УФ-видимі спектри вимірювали на спектрофотометрі Shimadzu UV3600.Спектри флуоресценції записували на спектрофлуориметрі Shimadzu RF-6000.Спектри ЕПР записували на приладі Bruker EMXmicro-6/1.Морфологію та структуру підготовлених зразків досліджували на приладах FEI Tecnai G20 (TEM) та Bruker Icon (AFM), що працюють за напруги 200 кВ.Динамічне розсіювання світла (DLS) проводили на аналізаторі Nanobrook Omni (Brookhaven).Фотоелектрохімічні властивості вимірювали на електрохімічній установці (CHI-660, Китай).Фотоакустичні зображення були отримані за допомогою системи FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Конфокальні зображення були отримані за допомогою конфокального мікроскопа Olympus FV3000.Аналіз FACS проводили на проточному цитометрі BD Calibur.Експерименти високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) проводили на системі Waters Alliance e2695 з використанням детектора 2489 UV/Vis.Тести гель-проникаючої хроматографії (GPC) записували на приладі Thermo ULTIMATE 3000 з використанням детектора показника заломлення ERC RefratoMax520.
[(η6-p-цим)Ru(фендіо)Cl]Cl (фендіо = 1,10-фенантролін-5,6-діон)64 (481,0 мг, 1,0 ммоль), 4,7-біс[4 -(N, N-дифеніламіно)феніл]-5,6-діаміно-2,1,3-бензотіадіазол 65 (652,0 мг, 1,0 ммоль) і крижану оцтову кислоту (30 мл) перемішували в холодильнику зі зворотним холодильником протягом 12 годин.Потім розчинник видаляли у вакуумі за допомогою роторного випарника.Отриманий залишок очищали колонковою флеш-хроматографією (силікагель, CH2Cl2:MeOH=20:1) з отриманням RuDA у вигляді зеленого порошку (вихід: 877,5 мг, 80%).задній прохід.Обчислено для C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Знайдено: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1Н ЯМР (600 МГц, d6-ДМСО) δ 10,04 (с, 2Н), 8,98 (с, 2Н), 8,15 (с, 2Н), 7,79 (с, 4Н), 7,44 (с, 8Н), 7,21 (д, J = 31,2 Гц, 16H), 6,47 (с, 2H), 6,24 (с, 2H), 2,69 (с, 1H), 2,25 (с, 3H), 0,99 (с, 6H).13C ЯМР (150 МГц, D6-DMSO), δ (ppm) 158,03, 152,81, 149,31, 147,98, 147,16, 139,98, 136,21, 135,57, 134,68, 130,34, 130,02, 128,68, 128,01, 125,51, 122. , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Синтез 4,7-біс[4-(N,N-діетиламіно)феніл-5,6-діаміно-2,1,3-бензотіадіазолу (L2): L2 був синтезований у дві стадії.Pd(PPh3)4 (46 мг, 0,040 ммоль) додавали до N,N-діетил-4-(трибутилстанніл)аніліну (1,05 г, 2,4 ммоль) і розчину 4,7-дибром-5,6-динітро - 2, 1,3-бензотіадіазол (0,38 г, 1,0 ммоль) у сухому толуолі (100 мл).Суміш перемішували при 100°C протягом 24 годин.Після видалення толуолу у вакуумі отриману тверду речовину промивали петролейним ефіром.Потім суміш цієї сполуки (234,0 мг, 0,45 ммоль) і порошку заліза (0,30 г, 5,4 ммоль) в оцтовій кислоті (20 мл) перемішували при 80°C протягом 4 годин.Реакційну суміш виливали у воду і отриману коричневу тверду речовину збирали фільтруванням.Продукт двічі очищали сублімацією під вакуумом, отримуючи зелену тверду речовину (126,2 мг, вихід 57%).задній прохід.Обчислено для C26H32N6S: C 67.79, H 7.00, N 18.24.Знайдено: C 67,84, H 6,95, H 18,16.1Н ЯМР (600 МГц, CDCl3), δ (м.д.) 7,42 (д, 4Н), 6,84 (д, 4Н), 4,09 (с, 4Н), 3,42 (д, 8Н), 1,22 (с, 12Н).13С ЯМР (150 МГц, CDCl3), δ (м.д.) 151.77, 147.39, 138.07, 131.20, 121.09, 113.84, 111.90, 44.34, 12.77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Сполуки готували та очищали за процедурами, подібними до RuDA.задній прохід.Обчислено для C48H48Cl2N8RuS: C 61.27, H 5.14, N 11.91.Знайдено: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, 1H ЯМР (600 МГц, d6-DMSO), δ (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (с, 4Н), 6,93 (с, 4Н), 6,48 (д, 2Н), 6,34 (с, 2Н), 3,54 (т, 8Н), 2,80 (м, 1Н), 2,33 (с, 3Н), 1,31 (т, 12Н), 1,07 (с, 6Н).13C ЯМР (151 МГц, CDCL3), δ (ppm) 158,20, 153,36, 148,82, 148,14, 138,59, 136,79, 135,75, 134,71, 130,44, 128,87, 128,35, 121,70, 111,84, 110,76, 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA розчиняли в MeOH/H2O (5/95, об./об.) у концентрації 10 мкМ.Спектр поглинання RuDA вимірювали кожні 5 хвилин на спектрофотометрі Shimadzu UV-3600 при опроміненні лазерним світлом з довжиною хвилі 808 нм (0,5 Вт/см2).Спектри ICG записували в тих же умовах, що й стандарт.
Спектри ЕПР записували на спектрометрі Bruker EMXmicro-6/1 з потужністю НВЧ 20 мВт, діапазоном сканування 100 Гс, модуляцією поля 1 Гс. 2,2,6,6-тетраметил-4-піперидон. (TEMP) і 5,5-диметил-1-піроліну N-оксид (DMPO) використовували як спінові пастки.Спектри електронного спінового резонансу реєстрували для змішаних розчинів РуДА (50 мкМ) і ТЕМФ (20 мМ) або ДМПО (20 мМ) під дією лазерного випромінювання з довжиною хвилі 808 нм (0,5 Вт/см2).
Розрахунки DFT і TD-DFT для RuDA проводилися на рівнях PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ у водному розчині за допомогою програми Гауса 1666,67,68.Розподіл HOMO-LUMO, дірок та електронів низькоенергетичного синглетного збудженого стану RuDA було побудовано за допомогою програми GaussView (версія 5.0).
Спочатку ми спробували виміряти ефективність генерації 1O2 RuDA за допомогою звичайної УФ-видимої спектроскопії з ICG (ΦΔ = 0,002) як стандарт, але фотодеградація ICG сильно вплинула на результати.Таким чином, квантовий вихід 1O2 RuDA був виміряний шляхом виявлення зміни інтенсивності флуоресценції ABDA приблизно на 428 нм при опроміненні лазером з довжиною хвилі 808 нм (0,5 Вт/см2).Експерименти проводили на RuDA та RuDA NP (20 мкМ) у воді/DMF (98/2, об./об.), що містить ABDA (50 мкМ).Квантовий вихід 1O2 розраховували за такою формулою: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS і rICG — швидкості реакції ABDA з 1O2, отримані з фотосенсибілізатора та ICG відповідно.APS і AICG – це поглинання фотосенсибілізатора та ICG при 808 нм відповідно.
АСМ вимірювання проводили в рідинних умовах за допомогою режиму сканування на системі АСМ Bruker Dimension Icon.Використовуючи відкриту структуру з рідкими клітинами, клітини двічі промивали етанолом і сушили струменем азоту.Вставте висушені клітини в оптичну головку мікроскопа.Негайно помістіть краплю зразка в резервуар рідини та помістіть його на кантилевер за допомогою стерильного одноразового пластикового шприца та стерильної голки.Ще одна крапля поміщається безпосередньо на зразок, і коли оптична головка опускається, дві краплі зливаються, утворюючи меніск між зразком і резервуаром рідини.АСМ вимірювання проводили за допомогою V-подібного нітридного кантилевера SCANASYST-FLUID (Bruker, твердість k = 0,7 Н·м-1, f0 = 120–180 кГц).
ВЕРХ-хроматограми отримували на системі Waters e2695, обладнаній колонкою phoenix C18 (250×4,6 мм, 5 мкм), використовуючи 2489 UV/Vis детектор.Довжина хвилі детектора 650 нм.Рухомими фазами A і B були вода і метанол відповідно, а швидкість потоку рухомої фази становила 1,0 мл·хв-1.Градієнт (розчинник B) був наступним: 100% від 0 до 4 хвилин, 100% до 50% від 5 до 30 хвилин і скидання до 100% від 31 до 40 хвилин.Руду розчиняли в змішаному розчині метанолу та води (50/50, за об’ємом) у концентрації 50 мкМ.Об'єм ін'єкції становив 20 мкл.
ГПХ аналізи записували на приладі Thermo ULTIMATE 3000, оснащеному двома колонками PL aquagel-OH MIXED-H (2×300×7,5 мм, 8 мкм) і детектором показника заломлення ERC RefratoMax520.Колонку GPC елюювали водою зі швидкістю потоку 1 мл/хв при 30°C.Рудні НЧ розчиняли в розчині PBS (рН = 7,4, 50 мкМ), об’єм ін’єкції становив 20 мкл.
Фотоструми вимірювали на електрохімічній установці (CHI-660B, Китай).Оптоелектронні відгуки при включенні та вимкненні лазера (808 нм, 0,5 Вт/см2) вимірювали при напрузі 0,5 В у чорному ящику відповідно.Використовували стандартну триелектродну комірку з L-подібним скловугільним електродом (GCE) як робочий електрод, стандартний каломельний електрод (SCE) як електрод порівняння та платиновий диск як протиелектрод.Як електроліт використовували 0,1 М розчин Na2SO4.
Лінія клітин раку молочної залози людини MDA-MB-231 була придбана у KeyGEN Biotec Co., LTD (Нанкін, Китай, каталожний номер: KG033).Клітини вирощували в моношарах у модифікованому середовищі Ігла за Дульбекко (DMEM, високий вміст глюкози), доповненому розчином 10% фетальної бичачої сироватки (FBS), пеніциліну (100 мкг/мл) і стрептоміцину (100 мкг/мл).Усі клітини культивували при 37°C у вологій атмосфері, що містить 5% CO2.
Аналіз MTT використовувався для визначення цитотоксичності RuDA та RuDA-NPs за присутності та відсутності світлового опромінення, з або без Vc (0,5 мМ).Ракові клітини MDA-MB-231 вирощували в 96-лункових планшетах при щільності клітин приблизно 1 × 105 клітин/мл/лунку та інкубували протягом 12 годин при 37,0°C в атмосфері 5% CO2 і 95% повітря.До клітин додавали розчинені у воді наночастинки RuDA та RuDA.Після 12 годин інкубації клітини піддавали впливу лазерного випромінювання потужністю 0,5 Вт см -2 при довжині хвилі 808 нм протягом 10 хвилин (300 Дж см -2 ), а потім інкубували в темряві протягом 24 годин.Потім клітини інкубували з МТТ (5 мг/мл) протягом ще 5 годин.Нарешті, змініть середовище на ДМСО (200 мкл), щоб розчинити отримані фіолетові кристали формазану.Значення OD вимірювали за допомогою рідера мікропланшетів з довжиною хвилі 570/630 нм.Значення IC50 для кожного зразка було розраховано за допомогою програмного забезпечення SPSS на основі кривих доза-відповідь, отриманих щонайменше з трьох незалежних експериментів.
Клітини MDA-MB-231 обробляли RuDA та RuDA-NP у концентрації 50 мкМ.Після 12 годин інкубації клітини опромінювали лазером з довжиною хвилі 808 нм і потужністю 0,5 Вт/см2 протягом 10 хв (300 Дж/см2).У групі вітаміну С (Vc) клітини обробляли 0,5 мМ Vc перед лазерним опроміненням.Потім клітини інкубували в темряві протягом додаткових 24 годин, потім фарбували кальцеїном AM і йодидом пропідію (20 мкг/мл, 5 мкл) протягом 30 хвилин, потім промивали PBS (10 мкл, pH 7,4).зображення пофарбованих клітин.