Новини

Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Ракові клітини розробили різні механізми, щоб подолати клітинний стрес і продовжувати прогресувати.Протеїнкіназа R (PKR) і її протеїновий активатор (PACT) є початковими реагуючими, які відстежують різні сигнали стресу, що призводить до інгібування клітинної проліферації та апоптозу.Однак регуляція шляху PACT-PKR в ракових клітинах залишається в основному невідомою.Тут ми виявили, що довга некодуюча РНК (lncRNA) аспартил тРНК синтетаза антисмислова РНК 1 (DARS-AS1) бере безпосередню участь в інгібуванні шляху PACT-PKR і сприяє проліферації ракових клітин.Використовуючи широкомасштабний функціональний скринінг асоційованої з раком lncRNA CRISPRi 971, ми виявили, що DARS-AS1 був пов’язаний зі значно посиленою проліферацією ракових клітин.Таким чином, нокаут DARS-AS1 пригнічує проліферацію клітин і сприяє апоптозу ракових клітин у різних лініях ракових клітин in vitro та значно зменшує ріст пухлини in vivo.Механічно DARS-AS1 зв’язується безпосередньо з доменом активації PACT і запобігає взаємодії PACT-PKR, тим самим зменшуючи активацію PKR, фосфорилювання eIF2α та інгібуючи апоптотичну загибель клітин.Клінічно DARS-AS1 широко експресується при багатьох ракових захворюваннях, і надмірна експресія цієї lncRNA вказує на поганий прогноз.Це дослідження з’ясовує специфічну для раку регуляцію шляху PACT-PKR за допомогою DARS-AS1 lncRNA і забезпечує іншу мішень для прогнозу та лікування раку.
Здатність адаптуватися до стресу є важливою характеристикою виживання та проліферації ракових клітин.Швидке розповсюдження та метаболічні ознаки раку досягають піку в суворих мікросередовищах — дефіцит поживних речовин, гіпоксія та низький рН, — які можуть викликати сигнальні шляхи загибелі клітин.Порушення регуляції чутливих до стресу генів, таких як p535, білки теплового шоку 6, 7, KRAS8, 9 і HIF-110, 11, 12, 13, часто спостерігається при раку, таким чином блокуючи апоптоз і сприяючи виживанню.
Протеїнкіназа R (PKR) є важливим датчиком стресу та субодиницею кінази фактора ініціації еукаріот 2α (eIF2α), регулятора трансляції, який зв’язує клітинний стрес із загибеллю клітини.PKR спочатку був ідентифікований як противірусний білок шляхом виявлення чужорідної дволанцюгової РНК (dsRNA).Після активації PKR фосфорилює eIF2α для інгібування синтезу вірусного та клітинного білка14,15,16.PACT (білок-активатор PKR) був ідентифікований як перший білок-активатор PKR за відсутності dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Завдяки прямій взаємодії з PKR PACT перетворює різні стреси (сироваткове голодування, лікування пероксидом або арсенітом) на PKR і подальші сигнальні шляхи.На додаток до фосфорилювання eIF2α, опосередкована PACT активація PKR викликає різні події, пов’язані з реакцією на стрес, включаючи зміну окислювально-відновного статусу через шлях PI3K/Akt24, посилену перевірку пошкодження ДНК через p5325,26 і NF-κB27,28 Регулює транскрипцію, 29. Враховуючи їх критичну роль у реакції на стрес, проліферації, апоптозі та інших ключових клітинних процесах, PKR і PACT є багатообіцяючими терапевтичними мішенями для багатьох захворювань, особливо раку30,31,32,33.Однак, незважаючи на це плейотропне функціональне та біологічне значення, регуляція активності PACT/PKR в ракових клітинах залишається невловимою.
lncRNA - це транскрипти розміром понад 200 нуклеотидів без потенціалу кодування білка.Оскільки передові проекти секвенування цілого геному ідентифікували тисячі lncRNA35,36, було докладено багато зусиль для з’ясування їхніх біологічних функцій.Зростаючий обсяг досліджень показує, що lncRNA беруть участь у багатьох біологічних процесах37, включаючи регуляцію інактивації Х-хромосоми38,39, імпринтинг40, транскрипцію41,42, трансляцію43 і навіть ріст раку44,45,46,47.Ці дослідження показали, що багато lncRNA беруть участь у шляху PACT/PKR.Одне з таких досліджень показало, що lncRNA ASPACT пригнічує транскрипцію PACT і збільшує ядерне утримання мРНК PACT.Інші дослідження показали, що lncRNA nc886 зв’язується з PKR і інгібує його фосфорилювання49,50.Досі не повідомлялося про lncRNA, що регулює PACT-опосередковану активацію PKR.
Антисмислова РНК 1 аспартил-тРНК-синтетази (DARS-AS1) була ідентифікована як онкогенна lncRNA51,52,53,54.Завдяки регулюванню miP-194-5p53, miP-12952 і miP-532-3p51 було показано, що DARS-AS1 сприяє зростанню світлоклітинної нирково-клітинної карциноми, карциноми щитовидної залози та недрібноклітинної карциноми легені відповідно.Тонг і його колеги також виявили, що DARS-AS1 сприяє прогресуванню мієломи шляхом підтримки стабільності РНК-зв'язуючого мотиву білка 39 (RBM39).Однак не було проведено жодних досліджень щодо того, чи бере участь ця lncRNA у регуляції активації PACT-PKR і реакції на стрес ракових клітин.
Тут ми провели широкомасштабний скринінг втрати функції за допомогою системи CRISPRi і визначили, що DARS-AS1 lncRNA сприяє проліферації кількох типів ракових клітин.Крім того, ми визначили основний механізм: DARS-AS1 зв’язується безпосередньо з PACT, пригнічує зв’язування PACT і PKR, запобігає фосфорилюванню eIF2α, нижчого субстрату PKR, і, зрештою, пригнічує апоптотичну загибель клітин.На закінчення наша робота розкриває DARS-AS1 lncRNA як регулятор шляху PACT-PKR і потенційну мішень для лікування раку та прогнозування.
Великі дослідження геномного профілю виявили сотні lncRNA, пов'язаних з раком.Однак їхня функція залишається здебільшого невідомою56.Щоб ідентифікувати перспективні кандидати на lncRNA, залучені до прогресування раку, ми провели скринінг втрати функції для зменшення проліферації в клітинній лінії колоректального раку SW620 за допомогою системи CRISPRi (рис. 1a).Унікальна особливість клітинних ліній раку товстої кишки SW480 і SW620 полягає в тому, що вони отримані з первинних і вторинних пухлин в одного пацієнта.Це дає цінне порівняння для вивчення генетичних змін у прогресуванні прогресуючого раку товстої кишки.Тому ми проаналізували транскриптоми клітинних ліній колоректального раку (SW480 і SW620) за допомогою секвенування РНК і зібрали деякі потенційні функціональні lncRNA з опублікованої літератури.На основі цих результатів ми розробили об’єднану бібліотеку sgRNA, що містить 7355 олігонуклеотидів sgRNA, спрямованих на 971 асоційовану з раком lncRNAs і 500 нецільових олігонуклеонів sgRNA для негативного контролю (додаткові дані 1).
Схематичне зображення скринінгу за допомогою системи CRISPRi.b збагачення sgRNA після скринінгу.Горизонтальна пунктирна лінія представляє log2 (зміна кратності) = ±0,58.Вертикальна пунктирна лінія вказує на значення p = 0,05.Чорні точки представляють нецільову sgRNA (позначену як NC).Червоні точки — це sgRNA, націлені на DARS-AS1.Сині крапки — це sgRNA, націлені на LINC00205, раніше описану онкогенну lncRNA.зміна кратності = (нормалізоване значення, день 17)/(нормалізоване значення, день 0).c Нокдаун sgRNA DARS-AS1 пригнічував ріст клітин.Смуги похибок представляють ± стандартне відхилення трьох експериментів.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 двобічний t-критерій Стьюдента.d Експресія DARS-AS1 в пухлинах (набір даних TCGA).em Експресія DARS-AS1 у парних нормальних і пухлинних зразках пацієнтів із BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP і COAD відповідно (набір даних TCGA).р-значення були отримані за допомогою парного двостороннього t-критерію Стьюдента.
Після конструювання плазміди та упаковки лентивірусу ми трансдукували лінію клітин колоректального раку dCas9-SW620 за допомогою вищевказаної бібліотеки в чотирьох незалежних експериментах з інфекцією.Множинність інфекції (MOI) для цих інфекцій становила 0,1–0,3, що вказує на те, що кожна клітина може бути трансфікована лише однією sgRNA.Через 18 днів культивування in vitro профіль збагачення цільових sgRNA зменшився або збільшився після скринінгу, тоді як кількість нецільових контрольних олігонуклеотидів залишилася відносно незмінною порівняно з профілем до скринінгу, що вказує на те, що наша мішень має високу скринінг-специфічність. бібліотека.Рис.1b і додаткова таблиця 1). LINC00205, який раніше повідомлялося про сприяння прогресуванню раку легенів і раку печінки 58, 59, 60, був відсіяний (log2 (зміна кратності) < -0,58, значення p < 0,05), що підтверджує надійність цього скринінгу (рис. 1b). LINC00205, який раніше повідомлялося про сприяння прогресуванню раку легенів і раку печінки 58, 59, 60, був відсіяний (log2 (зміна кратності) < -0,58, значення p < 0,05), що підтверджує надійність цього скринінгу (рис. 1b). LINC00205, про який раніше повідомлялося, що він дає можливість прогресувати раку легких і раку печені58, 59, 60, був виключений (log2 (кратне зміна) <-0,58, значення p <0,05), що підтверджує надійність цього скринінга (рис 1b). LINC00205, про який раніше повідомлялося, що сприяє прогресуванню раку легенів і раку печінки 58, 59, 60, було виключено (log2 (кратність зміни) <-0,58, p-значення <0,05), що підтверджує надійність цього скринінгу (рис. .1b). . Linc00205 之前 被 可 促进 肺癌 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （（（倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1b）。 证实 该 的 可靠性 （图 1b）。。。。。。 Linc00205 之前 被 可 促进 肺癌 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （（（倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1b）。 证实 该 的 可靠性 （图 1b）。。。。。。 LINC00205, про який раніше повідомлялося, що він дає змогу прогресувати раку легких і печених58, 59, 60, був виключений (log2 (кратне зміна) <-0,58, p-значення <0,05), що підтверджує надійність цього скринінга (рис 1b). LINC00205, про який раніше повідомлялося, що сприяє прогресуванню раку легенів і печінки58,59,60, було виключено (log2 (кратність зміни) <-0,58, p-значення <0,05), що підтверджує надійність цього скринінгу (рис. .1b).
Серед усіх перевірених lncRNAs також було перевірено DARS-AS1, причому кількість трьох споріднених олігонуклеотидів sgRNA значно зменшилася після 18 днів культивування, що свідчить про те, що нокдаун цієї lncRNA призвело до зниження проліферації раку (рис. 1b).Цей результат був додатково підтверджений аналізом MTS у клітинах колоректального раку, який показав, що швидкість росту нокдаун-клітин DARS-AS1 зменшилася лише вдвічі порівняно з контрольними клітинами (рис. 1c) і узгоджується з попередніми повідомленнями про кілька інших типів раку.: світлоклітинний рак нирки, рак щитовидної залози та недрібноклітинний рак легені51,52,53,55.Однак його функція та молекулярні механізми при колоректальному раку залишаються невивченими.Тому ми вибрали цю lncRNA для подальшого дослідження.
Щоб вивчити експресію DARS-AS1 у пацієнтів, ми всебічно проаналізували 10327 зразків пухлин із проекту Cancer Genome Atlas (TCGA).Наші результати показують, що DARS-AS1 широко експресується та значно активізується в здорових клітинах у різноманітних пухлинах, включаючи аденокарциному товстої кишки (COAD), світлоклітинний рак нирки (KIRC) і папілярно-клітинний рак нирки (KIRP)..Дуже мало (рис. 1d і додаткова рис. 1a, b). Аналіз парних зразків здорових/пухлини додатково підтвердив значно вищу експресію DARS-AS1 у пухлинах уротеліальної карциноми сечового міхура (BLCA), світлоклітинної карциноми нирки (KIRC), аденокарциноми передміхурової залози (PRAD), плоскоклітинної карциноми легенів (LUSC) , карцинома ендометрію тіла матки (UCEC), аденокарцинома легенів (LUAD), гепатоцелюлярна карцинома печінки (LIHC), папілярно-клітинна карцинома нирки (KIRP) і аденокарцинома товстої кишки (COAD) (p значення < 0,05) (рис. 1e–m) . Аналіз парних зразків здорових/пухлини додатково підтвердив значно вищу експресію DARS-AS1 у пухлинах уротеліальної карциноми сечового міхура (BLCA), світлоклітинної карциноми нирки (KIRC), аденокарциноми передміхурової залози (PRAD), плоскоклітинної карциноми легенів (LUSC) , карцинома ендометрію тіла матки (UCEC), аденокарцинома легенів (LUAD), гепатоцелюлярна карцинома печінки (LIHC), папілярно-клітинна карцинома нирки (KIRP) і аденокарцинома товстої кишки (COAD) (p значення < 0,05) (рис. 1e–m) .Аналіз парних здорових/пухлинних зразків також підтвердив значно вищу експресію DARS-AS1 у пухлинах уротеліальної карциноми сечового міхура (BLCA), світлоклітинної ниркової та нирково-клітинної карциноми (KIRC), аденокарциноми простати (PRAD), плоскоклітинної карциноми легень (LUSC)., карцинома ендометрії тіла матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцелюлярна карцинома печені (LIHC), папілярно-клітинна карцинома шкірки (KIRP) і аденокарцинома товстої кишки (COAD) (значення p <0,05) (рис. 1e– м) . ендометріальна карцинома тіла матки (UCEC), аденокарцинома легень (LUAD), гепатоцелюлярна карцинома печінки (LIHC), папілярно-клітинна карцинома нирки (KIRP) і аденокарцинома товстої кишки (COAD) (значення p < 0,05) (рис. 1e–m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 了 dars-as1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 (blca) 、 肾 透明 细胞癌 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的显着 更 高 表达 ，. <0,05)（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 内膜 癌 （（u 显着 更 表达 ， 内膜 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Аналіз парних зразків здорових/пухлини додатково підтвердив роль DARS-AS1 у пухлинах уротеліальної карциноми сечового міхура (BLCA), світлоклітинної нирково-клітинної карциноми (KIRC), аденокарциноми простати (PRAD) і плоскоклітинної карциноми легенів (LUSC).експресія при карциномі тіла матки (UCEC), аденокарциномі легкого (LUAD), гепатоцелюлярній карциномі (LIHC), почечно-почечной папілярно-клітинній карциномі (KIRP) і аденокарциномі товстої кишки (COAD) (значення p <0,05) (рис. 1е). -м). експресія в карциномі тіла матки (UCEC), аденокарциномі легенів (LUAD), гепатоцелюлярній карциномі (LIHC), нирково-папілярно-клітинній карциномі (KIRP) і аденокарциномі товстої кишки (COAD) (значення p <0,05) (Рисунок 1e -m).У сукупності ці результати вказують на те, що DARS-AS1 широко та високо виражений у різноманітних ракових захворюваннях.
Оскільки DARS-AS1 і DARS (ген, що кодує антисмисловий ланцюг) мають однаковий промотор і розташовані поруч один з одним, ми розробили shRNA спеціально для нокдауну DARS-AS1, але не DARS (додаткова рис. 2a, b і додаткова таблиця 2) .Окрім SW620, ми також використовували три інші клітинні лінії, які високо експресують DARS-AS1, для вивчення ефективності та функції нокдауну shRNA (додаткова таблиця 3).Наші результати показали, що всі три розроблені shRNAs досягли принаймні 80% ефективності нокдауну DARS-AS1 з незначним впливом на кількість мРНК DARS (додатковий рис. 2c–f).Крім того, ми виявили, що нокдаун DARS-AS1 за допомогою цих shRNA значно пригнічує ріст клітин у клітинних лініях колоректального раку SW620 (49,7%) і HCT116 (27,7%), лінії клітин раку молочної залози MBA-MD-231 (53,4%).) і лінії клітин гепатоми HepG2 (зниження на 92,7%), а також на їхню здатність утворювати незакріплені сфери (середнє зменшення ~50,8%, 44,6%, 40,7% і 75,7% на клітинну лінію) (рис. 2a,b).У SW620 результати аналізу утворення колоній додатково підтвердили, що shRNA DARS-AS1 значно пригнічує проліферацію клітин із середнім зниженням приблизно на 69,6% (рис. 2c).
Вплив контрольної shRNA і DARS-AS1 shRNA на клітинну проліферацію (a) і формування сфероїдів (b) у клітинах SW620, HCT116, MBA-MD-231 і HepG2.c Вплив контрольної shRNA та DARS-AS1 shRNA на утворення колоній у клітинах SW620.Клітинна проліферація (d), утворення сфероїдів (e) і утворення колоній (f) клітин SW620, що надекспресують DARS-AS1.Наведені дані є середнім значенням ± стандартне відхилення трьох експериментів.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 і *** p ≤ 0,001 за двобічним t-критерієм Стьюдента.
Щоб доповнити дослідження втрати функції, ми потім створили клітини SW620 із надмірною експресією DARS-AS1 (додаткова рис. 2g).Надмірна експресія DARS-AS1 значно збільшила ріст клітин (у 1,8 раза), формування незакріплених сфероїдів (1,4 раза) та утворення колоній (3,3 раза) у клітинах SW620 (рис. 2d–f).Ми підтвердили цей результат, використовуючи іншу лінію клітин, що експресує DARS-AS1, A549.Ця посилена клітинна проліферація внаслідок надекспресії DARS-AS1 також спостерігалася в клітинах A549 (додаткова рис. 2h, i та додаткова таблиця 3).У сукупності ці дослідження посилення та втрати демонструють, що DARS-AS1 сприяє проліферації ракових клітин in vitro.
Щоб дослідити основний механізм, за допомогою якого DARS-AS1 регулює проліферацію клітин, ми виконали спадний аналіз РНК, щоб визначити його потенційних партнерів по зв’язуванню білка.Результати RT-qPCR показали, що близько 86,2% DARS-AS1 знаходиться в цитоплазмі клітин SW620 (додатковий рис. 3a).Транскрибовану in vitro біотинільовану DARS-AS1 або псевдоРНК потім інкубували з лізатами клітин SW620 з наступним розділенням SDS-PAGE.Подальше фарбування сріблом показало, що чітка смуга (~38 кДа) була значно збагачена у зразках DARS-AS1, але не у зразках фіктивної РНК або кульок (рис. 3a).Ця смуга була ідентифікована як PKR-активуючий білок (PACT) за допомогою мас-спектрометрії (MS) і додатково підтверджена імуноблоттингом у клітинних лініях SW620, HCT116 і HepG2 (рис. 3a,b).Збагачення DARS і споріднених білків PACT – PKR і TRBP – також було досліджено за допомогою аналізу РНК методом вестерн-блоттингу (WB).Результати показали, що не було виявлено прямої взаємодії між РНК DARS-AS1 і цими трьома білками (додатковий рис. 3b).Специфічна взаємодія між DARS-AS1 і PACT була додатково підтверджена аналізом імунопреципітації РНК (RIP), який показав, що DARS-AS1 був значно збагачений антитілами проти PACT, але не іншими контрольними РНК (рис. 3c).Щоб визначити, чи взаємодіє DARS-AS1 безпосередньо з PACT за відсутності будь-яких інших клітинних компонентів, було проведено аналіз біошарової інтерферометрії (BLI) in vitro з використанням очищеного PACT.Мічену біотином DARS-AS1 або фіктивну РНК іммобілізували на біосенсорах стрептавідину (SA), а потім інкубували в кінетичному буфері, що містить 1 мкМ PACT.Примітно, що PACT міцно зв’язувався з DARS-AS1 (значення KD ~26,9 нМ), але не з імітацією РНК (рис. 3d).У сукупності ці результати демонструють пряму взаємодію та високу спорідненість між DARS-AS1 і PACT.
Аналіз витягування РНК виявив взаємодію DARS-AS1 з PACT у клітинах SW620.Вище, фарбування сріблом споріднених білків.Нижні імуноблоти проводили з антитілом до PACT.b Аналіз випадання РНК проводили в клітинах HCT116 (верхня) і HepG2 (нижня).Збагачення PACT було виявлено за допомогою імуноблотингу.Аналіз імунопреципітації кРНК (RIP) проводили в клітинах SW620 з використанням зазначених антитіл.d Криві зв’язування PACT з повнорозмірним DARS-AS1 або контрольною РНК були отримані за допомогою інтерферометрії біошарів (BLI).РНК іммобілізували на стрептавідиновому біосенсорі.Для вимірювання асоціації використовували 1 мкМ PACT.Аналіз витягування РНК проводили з використанням біотинільованого повнорозмірного DARS-AS1 або усіченого (вгорі).Імуноблот, який показує отриманий PACT (внизу).f Очищений помічений PACT інкубували з біотинільованим повнорозмірним DARS-AS1 або усіченим (як у e) для аналізу RIP in vitro.Екстрагована РНК була перевірена за допомогою RT-qPCR.g Відносну спорідненість різних фрагментів РНК до PACT було отримано за допомогою біошарової інтерферометрії.Для аналізу використовували 100 нМ РНК і 1 мкМ RAST.h Дослідження RIP in vitro проводили з використанням очищеного інтактного або усіченого міченого PACT.Екстрагована РНК була перевірена за допомогою RT-qPCR.i Швидкість росту клітин SW620 із надмірною експресією DARS-AS1, PACT або обох.j Надмірна експресія повнорозмірного або усіченого DARS-AS1 у клітинах SW620 мала різний вплив на ріст клітин.k Апоптоз був виявлений за допомогою імуноблоттингу з антитілом до PARP.l Нокаут DARS-AS1 індукує апоптоз клітин SW620, як показано за допомогою проточної цитометрії.Наведені дані є середнім значенням ± стандартне відхилення трьох експериментів. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, за двобічним критерієм Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, за двобічним критерієм Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 за двостороннім критерієм Стюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 за двобічним t-критерієм Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 за двостороннім критерієм Стюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 за двобічним t-критерієм Стьюдента.
Потім ми створили три біотинільовані фрагменти РНК DARS-AS1 за допомогою транскрипції in vitro, щоб ідентифікувати область DARS-AS1, необхідну для асоціації PACT (рис. 3e).Результати аналізу РНК показали, що кожен фрагмент міг взаємодіяти з PACT, але 3'-кінцева область (384–768 нуклеотидів, позначених A3) показала більше 1–384 нуклеотидів, позначених A1) (рис. 3e).Подібні результати спостерігалися в аналізі RIP in vitro з використанням рекомбінантного PACT (рис. 3f).У відповідності з цими результатами експерименти зі зв’язування іммобілізованих фрагментів РНК з PACT за допомогою BLI також показали, що PACT має вищу спорідненість до A3 (384–768 нт) (значення KD приблизно 94,6 нМ), хоча майже не зв’язується з іншими ділянками.(Рис. 3d).
Ми також перевірили асоційовані зв'язувальні області в PACT.PACT містить три функціональні домени, два з яких є консервативними дволанцюговими РНК-зв’язуючими доменами (dsRBD) і третій домен (позначений D3), який діє як активатор білкових взаємодій.Щоб перевірити здатність кожного домену до зв’язування lncRNA, ми сконструювали три мутації, які видалили кожен із трьох доменів, і провели RIP-аналіз in vitro.Наші результати показали, що делеція третього домену (D3) PACT значно зменшила його взаємодію з DARS-AS1 (у 0,11 раза порівняно з інтактним PACT) порівняно з двома іншими мутаціями (рис. 3h), було показано, що вивільнення D3 взаємодіяв з DARS.-AC1.У сукупності ці результати свідчать про те, що взаємодія між DARS-AS1 і PACT може відбуватися переважно через 3'-кінець DARS-AS1 і домен D3 PACT.
Ми відзначили, що DARS-AS1 не впливав на експресію PACT, а PACT не впливав на DARS-AS1 (додатковий рис. 3c).Потім ми дослідили вплив нокдауну PACT на ріст клітин.На відміну від DARS-AS1, відносні клітини росли в 1,5–3 рази швидше, коли PACT був збитий (додатковий рис. 3d).Результати аналізу утворення колоній показали, що клітини утворили 2-3-кратні колонії після обробки shRNA за допомогою PACT (додаткова фіг. 3e).Щоб перевірити, чи DARS-AS1 регулює клітинну проліферацію за допомогою PACT, ми створили клітини SW620 із надмірною експресією PACT, DARS-AS1 або обох.Надмірна експресія PACT показала значне пригнічення проліферації клітин (Фігура 3i).Хоча надмірна експресія DARS-AS1 сама по собі значно сприяла проліферації клітин, не було суттєвої різниці у швидкості росту клітин із надмірною експресією DARS-AS1 і PACT.Ці результати свідчать про те, що PACT може протидіяти підвищеній проліферації, спричиненій надмірною експресією DARS-AS1.
Оскільки різні ділянки DARS-AS1 мають різні PACT-зв'язувальні здібності, ми досліджували їхній відносний вплив на проліферацію клітин шляхом різної надекспресії фрагментів DARS-AS1.Порівняно з двома іншими фрагментами, DARS-AS1 був надмірно експресований на 3'-кінці (384–768 нт), головній пов’язаній з PACT області в DARS-AS1, яка мала найвищу здатність стимулювати проліферацію клітин (рис. 3j).Ці результати вказують на позитивну кореляцію між здатністю зв’язування та біологічною функцією DARS-AS1.
Повідомлялося, що PACT є проапоптозним білком19.Тому ми досліджували вплив DARS-AS1 на апоптоз.Як і очікувалося, нокдаун DARS-AS1 значно збільшив розщеплення PARP у клітинах SW620 і збільшив частку аннексин V-позитивних клітин у клітинних лініях SW620, HCT116, HepG2 і MBA-MD-231 (рис. 3k).3).3f–h), що вказує на те, що антиапоптотичний ефект DARS-AS1 у ракових клітинах протилежний функції PACT, що індукує апоптоз.У сукупності ці результати свідчать про те, що механізм онкогенної функції DARS-AS1 може бути через пригнічення функції PACT.
Далі ми дослідили функціональні наслідки асоціації DARS-AS1-PACT.Повідомлялося, що PACT активує PKR шляхом прямої взаємодії, що згодом посилює фосфорилювання eIF2α, спричиняючи трансляційну делецію та апоптоз17.Спочатку ми перевірили, чи впливає DARS-AS1 на клітинну локалізацію PACT і PKR.Конфокальна флуоресцентна мікроскопія показала, що PACT і PKR були сильно локалізовані в клітинах SW620 із середнім коефіцієнтом кореляції Пірсона 0,72.Тим часом, надмірна експресія DARS-AS1 значно зменшила спільну локалізацію PACT і PKR (середній коефіцієнт кореляції Пірсона 0,61) (рис. 4а).Щоб дослідити, чи може DARS-AS1 модулювати взаємодію PACT-PKR, ми провели аналіз спільної імунопреципітації (co-IP) з антитілами проти PACT у лізатах клітин SW620.PKR був високо збагачений анти-PACT у контрольних клітинах, у той час як відновлення PKR було значно знижено в лізатах з клітин із надмірною експресією DARS-AS1 (рис. 4b).Очищені мічені PACT і PKR використовували для аналізів зв'язування білків in vitro.Відповідно, ті, які забезпечували DARS-AS1, але не мали контрольної РНК, продемонстрували пригнічену взаємодію PACT-PKR (рис. 4c).Усі результати показали, що DARS-AS1 порушив зв’язок PACT і PKR.
a За допомогою конфокальної флуоресцентної мікроскопії спостерігали спільну локалізацію PACT і PKR у контрольних клітинах або клітинах із надмірною експресією DARS-AS1.Ядра фарбували DAPI.Статистичні результати отримані за 16 фотографіями.b Коімунопреципітація (co-IP) з використанням анти-PACT антитіл у клітинних лізатах контрольних клітин SW620 або клітин із надмірною експресією DARS-AS1.c Мічений PACT, очищений PKR і транскрибований in vitro за допомогою DARS-AS1 або імітаційної РНК інкубували для аналізу зв’язування білка in vitro.Для імунопреципітації використовували антитіла проти флага.d Імуноблоти із зазначеними антитілами проводили в клітинах SW620 і HCT116, трансфікованих контрольною shRNA або DARS-AS1-shRNA з подальшим сироватковим голодуванням.Рівні експресії DARS-AS1 змінюють чутливість клітин до тапсигаргіну.Клітини SW620 трансфікували shRNA DARS-AS1, плазмідою надекспресії DARS-AS1 або контрольною плазмідою.Клітини обробляли тапсигаргіном протягом 48 годин і визначали життєздатність клітин за допомогою реагенту MTS.f Транскрибована in vitro DARS-AS1 або фіктивна РНК і очищена PACT використовувалися для аналізу активації in vitro та виявлення імуноблоту.g Імуноблоти з використанням цих антитіл проводили на клітинах SW620-ctrl (ліворуч) або клітинах, які надекспресують мутанти PKR (праворуч).Потім ці клітини трансфікували контрольною shRNA або DARS-AS1-shRNA з наступним сироватковим голодуванням.h Проточна цитометрія показала, що інактивація мутантного PKR компенсує індукований DARS-AS1 апоптоз у клітинах SW620.i Імуноблоти із зазначеними антитілами проводили в клітинах SW620 (ліворуч) або HCT116 (праворуч).Клітини, трансфіковані контрольною shRNA або DARS-AS1 shRNA, позбавляють сироватки та доповнюють 100 нМ інгібітору PKR C16 або DMSO.Масштабна шкала = 5 мкм.Наведені дані є середнім значенням ± стандартне відхилення трьох експериментів.* p ≤ 0,05 двобічний t-критерій Стьюдента.
Загальноприйнято вважати, що як тільки PACT взаємодіє з PKR17, можна індукувати фосфорилювання PKR на Thr451.Наші результати показали, що рівень фосфорилювання PKR був значно підвищений у клітинах нокдауну DARS-AS1 після сироваткового голодування (рис. 4d і додаткова рис. 4a).Відповідно, ми виявили, що фосфорилювання eIF2α, основного субстрату PKR, також було значно збільшено за допомогою shRNA DARS-AS1 (рис. 4d і додаткова рис. 4a).Тапсигаргін є стресовим фактором ЕР, який змушує ЕР вивільняти Ca2+.Повідомлялося, що лікування тапсигаргіном індукує експресію та активацію PACT, який далі взаємодіє з PKR та активує його, що призводить до апоптозу шляхом збільшення фосфорилювання eIF2α 18,61.Тут ми використали тапсигаргін як стимулятор шляху PACT/PKR, щоб дослідити, чи може DARS-AS1 допомогти клітинам подолати стрес шляхом інгібування шляху PACT/PKR.Ми спостерігали, що рівень експресії DARS-AS1 позитивно корелював із стійкістю клітин до тапсигаргіну.Клітини SW620 з надмірною експресією DARS-AS1 вижили краще при лікуванні тапсигаргіном, тоді як клітини з нокдауном DARS-AS1 стали більш чутливими (рис. 4e).Відповідно до цих результатів, надмірна експресія DARS-AS1 зменшила індуковане тапсигаргіном фосфорилювання PKR (додатковий рис. 4b).Навпаки, після лікування тапсигаргіном PKR і eIF2α були фосфорильовані більшою мірою в нокдаун-клітинах DARS-AS1 порівняно з контрольними клітинами (додатковий рис. 4b).Цікаво, що тапсигаргін індукував експресію DARS-AS1 залежно від дози, що може вказувати на антистресову функцію DARS-AS1 (додатковий рис. 4c).Крім того, ми провели аналізи активації in vitro, щоб підтвердити ці спостереження.Коротко, PKR очищали з клітинних лізатів за допомогою антитіл проти PKR, потім інкубували з рекомбінантним PACT і DARS-AS1, транскрибованим in vitro.Після ферментативної реакції фосфо-PKR виявляли за допомогою WB.Наші результати показали, що фосфорилювання PKR значно пригнічувалося DARS-AS1, але не контрольною РНК (рис. 4f).Ці результати in vitro та in vivo свідчать про те, що DARS-AS1 інгібує PACT-опосередковану активацію PKR.У той же час ми також спостерігали зниження відновлення PACT у присутності DARS-AS1 (рис. 4f).Цей результат узгоджується з результатами аналізу зв’язування білків in vitro (рис. 4c) і знову ілюструє блокуючу функцію DARS-AS1 для асоціації PACT-PKR.
Ser246 і Ser287 в домені D3 PACT необхідні для активації PKR під клітинним стресом.Заміна двох залишків серину на аланін дала мутантний PACT (mutD), який активував PKR за відсутності стресу, а заміна на аланін (mutA) змінила протокол.Оскільки ми продемонстрували важливість цього домену в прямому зв’язку з DARS-AS1, ми створили ці два мутанти PACT, щоб перевірити, чи можуть ці залишки також брати участь у взаємодії з DARS-AS1.Цікаво, що обидва мутанти втратили здатність зв’язуватися з DARS-AS1 (додатковий рис. 4d), що свідчить про те, що для ефективної взаємодії з DARS-AS1 може знадобитися повна структура білка PACT.
Крім того, наші результати також свідчать про те, що індуковане DARS-AS1-shRNA інгібування клітинної проліферації може бути частково відновлено шляхом надмірної експресії домінантно негативного мутанта PACT (PACTmutA) або домінантно негативного мутанта PKR (PKRmut) (Додатковий рис. 4e. e).Надмірна експресія домінантно-негативних мутантів PKR знижувала фосфорилювання PKR, індуковане нокдауном DARS-AS1, а також фосфорилювання eIF2α в клітинах, позбавлених сироватки (рис. 4g).Що більш важливо, частка апоптичних клітин, індукованих нокдауном DARS-AS1, також була знижена в клітинах, які надмірно експресують PKRmut (рис. 4h і додаткова рис. 4g).Інгібування активності кінази PKR також порушує функцію DARS-AS1, оскільки результати показали, що нокдаун DARS-AS1 рідко викликає фосфорилювання PKR та eIF2α, коли клітини обробляли PKR-специфічним інгібітором C16 (рис. 4i та додаткова рис. 4h).).У сукупності наші результати свідчать про те, що DARS-AS1 сприяє проліферації клітин, принаймні частково, шляхом інгібування PACT-опосередкованої активації PKR.
Для подальшого вивчення ролі DARS-AS1 у пухлиногенезі ми провели експерименти in vivo з використанням моделі ксенотрансплантата миші. Результати показують, що нокдаун DARS-AS1 різко зменшив ріст пухлини у мишей (p значення <0,0001) (рис. 5a). Результати показують, що нокдаун DARS-AS1 різко зменшив ріст пухлини у мишей (p значення <0,0001) (рис. 5a). Результати показують, що нокдаун DARS-AS1 резко знижує зростання опухолі в миші (значення p <0,0001) (рис. 5а). Результати показують, що нокдаун DARS-AS1 різко зменшує ріст пухлини у мишей (значення p < 0,0001) (рис. 5а).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a）。 Результати показали, що нокдаун DARS-AS1 значно знижує зростання опухолі в миші (значення р <0,0001) (рис. 5а). Результати показали, що нокдаун DARS-AS1 значно зменшив ріст пухлини у мишей (p <0,0001) (рис. 5a).Таким чином, у групі нокдауну DARS-AS1 спостерігалося значне зменшення середнього об’єму пухлини приблизно на 72,9% і середньої маси пухлини приблизно на 87,8% (рис. 5b-d).Ці результати переконливо свідчать про те, що DARS-AS1 може значно сприяти росту пухлини in vivo.
Вплив нокдауну ad DARS-AS1 на колоректальний онкогенез у голих мишей.Показано криві росту (a), розмір пухлини (b), вагу (c) і зображення пухлини (d).Смуги помилок представляють ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, за двобічним t-критерієм Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001, за двобічним t-критерієм Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 за двостороннім критерієм Стюдента. n = 10. ****p < 0,0001 двобічний t-критерій Стьюдента.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 за двостороннім критерієм Стюдента. ****p < 0,0001 двобічний t-критерій Стьюдента.Каплан-Майєр проаналізував кореляцію між рівнями експресії DARS-AS1 і загальною виживаністю у пацієнтів з UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM і LGG.Високий рівень експресії DARS-AS1 у пацієнтів був у верхніх 50%;низький рівень експресії DARS-AS1 у пацієнтів був у нижніх 50%.р-значення визначали за допомогою логарифмічного рангового тесту.f Запропонована модель, у якій DARS-AS1 регулює шлях PACT-PKR і ріст пухлини.
Щоб краще зрозуміти клінічний вплив DARS-AS1, ми дослідили кореляцію між його експресією та виживанням пацієнтів.Аналізуючи набір даних TCGA, ми виявили, що більш висока експресія DARS-AS1 була пов’язана з увеальною меланомою (UVM), нирковою хромофобією (KICH), нирковою папілярно-клітинною карциномою (KIRP), мезотеліомою (MESO), мультиплексом.Нижча виживаність була значною мірою пов’язана з морфозом гліобластоми (GBM) і пацієнтами з гліомою мозку низького ступеня злоякісності (LGG) (рис. 5e).Ці результати свідчать про те, що DARS-AS1 може відігравати важливу роль у клінічній прогресії пухлини та може бути потенційним прогностичним біомаркером у багатьох ракових захворюваннях.
У цьому дослідженні, використовуючи широкомасштабний функціональний скринінг CRISPRi, ми визначили, що lncRNA DARS-AS1 долає стрес ракових клітин шляхом регулювання двох ключових стрес-респондентів, PACT і PKR.Взаємодіючи безпосередньо з PACT, DARS-AS1 інгібував PACT-опосередковану активацію PKR, тим самим запобігаючи апоптотичній загибелі клітин і сприяючи проліферації клітин (рис. 5f).Посилення регуляції DARS-AS1 спостерігалося при багатьох типах раку, що свідчить про те, що його функція сприяння виживанню ракових клітин у стресових умовах може бути широко застосована до багатьох типів раку.
PACT було ідентифіковано як білок-активатор PKR, а опосередкована PACT активація PKR відіграє важливу роль у відповідях на стрес, регулюючи транскрипцію, трансляцію, апоптоз та інші важливі клітинні процеси62.Десятиліттями робилися спроби зрозуміти специфічну для раку регуляцію каскаду PACT-PKR.Тут наше дослідження виявило інший механізм регуляції PACT-PKR в ракових клітинах через клітинну lncRNA DARS-AS1, яка безпосередньо зв’язується з PACT, блокує взаємодію PACT-PKR, пригнічує активацію PKR і фосфорилювання eIF2α, тим самим пригнічуючи індукований стресом апоптоз і стимулювання можливої ​​проліферації раку.клітини.Це відкриття проливає світло на потенційні мішені lncRNA для прогнозу та терапії раку.
Наші дані показали, що нокдаун DARS-AS1 сенсибілізує клітини до сироваткового голодування зі значним збільшенням фосфорильованого PKR і eIF2α.Ці результати свідчать про те, що DARS-AS1 сприяє виживанню ракових клітин у суворих умовах шляхом пригнічення активності PACT/PKR.Кілька інших некодуючих РНК, таких як ASPACT і nc886, також залучені до осі PACT/PKR, знижуючи регуляцію мРНК PACT48 або регулюючи автофосфорилювання шляхом зв’язування з PKR49, 50, 64.Серед них DARS-AS1 виступає руйнівником асоціації PACT-PKR.Це дослідження збагачує наше розуміння регуляції осі PACT/PKR і ролі lncRNA у відповідях на стрес.
PACT містить три окремі домени.Кожного з перших двох dsRBD достатньо для досягнення високої афінності зв’язування PACT з PKR, тоді як третій домен (D3) необхідний для активації PKR in vitro та in vivo.Наше дослідження показало, що DARS-AS1 переважно взаємодіє з доменом D3 (рис. 3h).Враховуючи великий розмір lncRNA (768 нуклеотидів), зв’язування DARS-AS1 з D3 може фізично інгібувати взаємодію між доменом PACT dsRBD і PKR, тим самим блокуючи асоціацію PACT і PKR.Точкові мутації PACT, які замінили Ser246 і Ser287 у D3 на аланін або аспартат, порушили його афінність зв’язування з DARS-AS1, вказуючи на важливість загальних структурних і електричних властивостей D3 у їх асоціації.Подальші деталі цього механізму знадобляться в майбутньому з використанням більш точного біохімічного аналізу та структурного аналізу PACT з високою роздільною здатністю.
Попередні дослідження показали, що DARS-AS1 сприяє проліферації клітин за допомогою кількох механізмів51,52,53.В одному прикладі дослідники помітили, що DARS-AS1 активізував свій ген DARS, що кодує антисмисловий білок, націлюючись на miP-194-5p у клітинах раку нирки.Однак у цьому дослідженні нокдаун DARS-AS1 мав незначний вплив на транскрипцію DARS при багатьох типах раку, включаючи принаймні колоректальний рак, рак молочної залози та печінки.Оскільки lncRNA демонструють специфічні для клітин і тканин моделі експресії, функціональні механізми можуть не зберігатися в різних типах раку, що може сприяти цій розбіжності між нашими спостереженнями та попередніми оцінками різних видів раку.Для з'ясування конкретних механізмів різних фізіологічних і патологічних процесів необхідні спеціальні дослідження.
Аналіз клінічних даних показав, що експресія DARS-AS1 в пухлинах обернено корелює з виживаністю хворих на рак, що підкреслює важливість осі DARS-AS1/PACT/PKR у прогнозі раку.Підсумовуючи, наше дослідження показує, що DARS-AS1 є регулятором сигнальної осі PACT/PKR, сприяє проліферації ракових клітин і пригнічує апоптоз під час відповіді на стрес, що забезпечує інший напрямок досліджень і становить інтерес для майбутніх досліджень потенційних методів лікування .
Клітинні лінії людини SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 і HEK293T були отримані від Національної інфраструктури ресурсів клітинних ліній у Китаї.Усі клітини витримували в середовищі DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) з додаванням 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) і 1% пеніцилін-стрептоміцину (Thermo Fisher Scientific) при 37°C, 5% CO2.інкубатор.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Анти-PKR, Abcam (ab184257);Анти-PKR (фосфо-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Анти-eIF2α, Abcam (A0764));анти-eIF2α (фосфор S51), Abcam (ab32157);анти-PACT (фосфор S246), Abgent (AP7744b);анти-β-тубулін, CST (2128);нормальний мишачий IgG, CST (5415S);нормальний кролячий IgG, CST (2729S).Антитіла розводили 1:1000 у PBST для вестерн-блоттингу та 1:100 для IP.
sgRNA були розроблені за допомогою загальнодоступного інструменту під назвою CRISPR-ERA66.Ми використали параметри інструменту за замовчуванням для розробки sgRNA, а алгоритм обчислив сайти зв’язування sgRNA в області 3 кб.з центром у TSS.Пули олігонуклеотидів sgRNA були синтезовані в CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) і клоновані в гуманізовані плазміди pgRNA (Addgene #44248).Загалом 12 мкг об’єднаної гуманізованої плазміди pgRNA, 7,2 мкг psPAX2 (Addgene #12260) і 4,8 мкг pMD2.G (Addgene #12259) були спільно трансфіковані в 5 x 106 HEK293T в 10-сантиметрових чашках за допомогою реагенту для трансфекції DNAfect клітин (CWBIO, Пекін, Китай), дотримуючись інструкцій виробника.Супернатанти, що містять вірус, збирали через 48 і 72 години після трансфекції та фільтрували через фільтр 0,45 мкм.Для скринінгу клітини SW620, що експресують злитий білок dCas9/KRAB, отримували шляхом трансдукції вірусу.Модифіковані клітини SW620 інфікували бібліотекою вірусів у чотирьох незалежних експериментах з інфікуванням при MOI 0,1-0,3 і брали проби з 2 мкг/мл пуроміцину (Sigma, St. Louis, MO) протягом 2 днів.Після цього клітини культивували протягом 18 днів in vitro з мінімальним охопленням бібліотеки 500 клітин/sgRNA для скринінгу.
Геномну ДНК екстрагували згідно з інструкціями QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Дюссельдорф, Німеччина; 51183).Загалом для створення бібліотеки використовували 100 мкг геномної ДНК на біологічний повтор.Ділянка sgRNA була ампліфікована двома раундами ПЛР і пов’язана зі штрих-кодом.
Продукти ПЛР очищали за допомогою гелю NucleoSpin® і набору для очищення ПЛР (MACHEREY-NAGEL, Дюрен, Німеччина; 740609.250) і кількісно визначали за допомогою набору для виявлення дволанцюгової ДНК Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Аналіз MTS використовували для вимірювання проліферації клітин.Клітини висівали в 96-лункові планшети з початковою щільністю 2000 клітин/лунку.Відносну кількість клітин вимірювали щодня в зазначений час протягом 4-6 днів.Для кожної лунки 20 мкл реагенту MTS (Promega) розбавляли 100 мкл DMEM, інкубували з клітинами протягом 4 годин при 37 °C, а потім вимірювали OD490.
Здатність до незакріпленого росту була виявлена ​​шляхом аналізу формування сфер.Коротко, 2000 клітин, трансфікованих shRNA DARS-AS1 або контрольною shRNA, культивували в мікропланшетах із ультранизьким прикріпленням (Corning) зі зміною середовища кожні 4 дні.Сфероїди підраховували через 14 днів.500 клітин, трансфікованих плазмідою надекспресії DARS-AS1 або контрольною плазмідою, використовували для аналізу посилення, інакше метод не змінювався.
РНК транскрибували за допомогою Т7 РНК-полімерази та біотин-16-UTP (Roche 1138908910) згідно з інструкціями Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Праймери, які тут використовуються, перераховані в Додатковій таблиці 4.
Ділянки PACT або PKR, що кодують білок, клонували в pET15b (Addgene #73619) і трансформували в BL21(DE3).Бактерії інкубували протягом ночі в LB, заповненому ампіциліном, а потім розводили у 100 разів свіжим LB.Коли OD600 середовища досягав 0,8, додавали 1 мМ IPTG, щоб індукувати експресію білка.Після інкубації протягом ночі з легким струшуванням (250 об/хв при 20°C) клітинний осад збирали центрифугуванням (4000 об/хв, 10 хв, 4°C).Ресуспендуйте клітинний осад у буфері для лізису (50 мМ Tris, pH 8,0, 250 мМ NaCl, 1 мМ PMSF) та інкубуйте на льоду протягом 30 хв, потім обробіть ультразвуком (15 хв, 5 с увімк./вимк., на льоду) і центрифугуйте (13 000 об/хв)., 30 хв, 4°С).Потім супернатант завантажували на смолу Ni-NTA (QIAGEN) 3 рази при 4°C, промивали 4 рази промивним буфером (50 мМ Трис, рН 8,0, 40 мМ імідазол, 250 мМ NaCl) і елюювали 3 рази із загальною кількістю 10 мл елюентного буфера (50 мМ Tris, рН 8,0, 250 мМ NaCl, 300 мМ імідазолу).Очищений білок визначали за допомогою WB, а концентрацію визначали за допомогою набору для аналізу білка Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Аналізи RIP проводили, як описано раніше, з модифікаціями.Коротко, 1x RIP-буфер (25 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 0,5% NP-40, інгібітор рибонуклеази РНКазин (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 мМ DDM, протеаза) лізує цитостатичний коктейль 1 x 107 (Roche, 1 мМ DTT) і центрифугувати при 13 000 об/хв протягом 15 хв при 4 °C.Потім супернатант інкубували з магнітними кульками білка A+G (Millipore), кон’югованими з 5 мкг антитіл проти PACT (Abeam) або IgG (CST).Намистини промивали 5 разів буфером 5x RIP, потім розщеплювали протеїназою K (NEB).РНК екстрагували тризолом і визначали за допомогою RT-qPCR.Праймери представлені в додатковій таблиці 5.
Аналіз RIP in vitro проводили відповідно до модифікованого стандартного протоколу аналізу RIP.Загалом 5 пмоль транскрибованої in vitro РНК розбавляли 1x буфером RIP і відпалювали шляхом інкубації при 65°C протягом 5 хвилин з подальшим повільним охолодженням до кімнатної температури.Загалом 5 пмоль інтактних або мутованих білків PACT, мічених прапорцями, очищали з E. coli.Інкубуйте з ренатурованою РНК протягом 2 годин при 4°C і дотримуйтесь описаної вище процедури для RIP-аналізу на анти-позначковий IP.
Для аналізу подовження РНК 1×107 клітин лізували буфером 1xRIP.Після центрифугування при 13000 об/хв протягом 15 хвилин при 4°C супернатант попередньо обробляли 30 мкл стрептавідину магнітними кульками (Beckman) протягом 2 годин при 4°C.Потім до очищеного лізату додавали тРНК дріжджів та інкубували з 40 пмоль ренатурованої РНК протягом ночі при 4°C, потім ще протягом 2 годин і додавали 20 мкл нових магнітних кульок стрептавідину, блокованих BSA.Етап промивання включав 4 рази з 5x RIP буфером і 4 рази з 1x RIP буфером.Відповідні білки елюювали буфером для елюції біотину (25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 12,5 мМ D-біотин, PMSF) і розділяли на NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Після фарбування сріблом (Beyotime Biotechnology) певні смуги вирізали та аналізували за допомогою MS.
Аналіз Co-IP був проведений для перевірки взаємодії між PACT і PKR.Коротко, лізати супернатантів готували шляхом інкубації 1 × 107 лізованих клітин у 1 × RIP-буфері з подальшим центрифугуванням при 13000 об/хв протягом 15 хвилин при 4 °C.Лізати завантажували магнітними кульками білка A + G, кон'югованими з 5 мкг анти-PACT антитіла, і обережно обертали протягом ночі при 4°C.Гранули промивали 3 рази буфером 5 × RIP, двічі буфером 1 × RIP і елюювали буфером 1 × SDS.Виділений білок аналізували за допомогою гелю SDS-PAGE і виявляли WB.
Два пмоль поміченого PACT і 1 пмоль PKR очищали від E. coli.Розведіть в 1 × RIP-буфері та інкубуйте з 10 пмоль ренатурованої РНК протягом 2 годин при 4 °C.Після цього їх інкубували з антитілом проти міченого білка A+G, кон’югованим магнітними кульками, протягом додаткових двох годин.Потім кульки чотири рази промивали буфером 1x RIP і елюювали буфером 1x SDS.Отримані PACT і PKR були виявлені WB.